金銀花尺蠖及棉鈴蟲的一種病原真菌鑒定△

馬維思，徐常青，張金良，董杰，喬海莉，郭昆，徐榮，陳君*，張大勇

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，昆明 650205；3.北京市植物保護站，北京 100029；4.加多寶集團種植資源部，北京 100176)

·中藥農業·

金銀花尺蠖及棉鈴蟲的一種病原真菌鑒定△

馬維思1,2，徐常青1，張金良3，董杰3，喬海莉1，郭昆1，徐榮1，陳君1*，張大勇4

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.云南省農業科學院藥用植物研究所，昆明 650205；3.北京市植物保護站，北京 100029；4.加多寶集團種植資源部，北京 100176)

目的：明確金銀花上的棉鈴蟲、金銀花尺蠖2種害蟲的病原真菌的分類地位，為尋找對藥材鱗翅目害蟲有高毒力的病原真菌提供材料。方法：通過分生孢子分離、培養，從受真菌侵染死亡的金銀花鱗翅目害蟲體表分離獲得昆蟲病原真菌，依據真菌的形態特征和ITS序列特征對其進行鑒定。結果：從12份受真菌感染死亡的幼蟲體表分離到12株形態特征一致的真菌，依據形態特征和ITS序列特征將其鑒定為萊氏野村菌Nomurearileyi。結論：萊氏野村菌為金銀花尺蠖及棉鈴蟲兩種金銀花鱗翅目害蟲的一種病原真菌，因其能夠在某些鱗翅目害蟲間形成流行病，對防治藥材害蟲具有應用潛力。

金銀花；金銀花尺蠖；棉鈴蟲；萊氏野村菌

金銀花LonicerajaponicaThunb是我國常用大宗中藥材，具有清熱解毒，涼散風熱、抗菌及抗病毒等功效[1]，在栽培過程中受到多種害蟲的危害，其中鱗翅目害蟲金銀花尺蠖Heterolochajinyinhuaphaga、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的危害比較嚴重，金銀花尺蠖在河南封丘一度成為危害金銀花的主要害蟲[2]，棉鈴蟲取食金銀花花蕾及幼嫩葉片，影響藥材的生產[3]。昆蟲病原真菌是生物防治藥材害蟲的理想材料，對保障藥材質量、產量和產區生態環境具有重要意義。國際上利用昆蟲病原真菌防治飛蝗以及按蚊等農林、衛生害蟲已經取得較大成功[4-5]，國內使用真菌殺蟲劑防治蝗蟲及椰心葉甲等害蟲也取得了較好的效果[6-7]，目前至少有11種蟲生真菌制成的殺蟲劑被注冊[8]，但關于利用昆蟲病原真菌防治藥材害蟲的研究與應用的報道還很少。本研究采集到12批受真菌感染死亡的金銀花鱗翅目害蟲的幼蟲，對其病原真菌進行分離鑒定，以期為進一步利用昆蟲病原真菌防治金銀花等藥材的害蟲提供基礎。

1 材料

幼蟲：從山東省臨沂市平邑縣的12株金銀花上，采集到受真菌侵染死亡的12批鱗翅目幼蟲，編號為SD1～SD12，經中國醫學科學院藥用植物研究所陳君研究員鑒定，除編號SD5的幼蟲為尺蛾科昆蟲金銀花尺蠖外，其余11批幼蟲均為夜蛾科昆蟲棉鈴蟲。

PPDA培養基：200 g馬鈴薯去皮切塊浸煮，濾除殘渣，20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，17 g瓊脂，加水定容至1 L，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，冷卻至50～60 ℃時，加入硫酸鏈霉素(30 mg·L-1)和青霉素鉀(30 mg·L-1)。

SDY液體培養基：10 g酵母浸膏，10 g蛋白胨，40 g葡萄糖，加水定容至1 L，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

主要試劑：Fungal DNA mini Kit真菌DNA提取試劑盒購自美科美(北京)生物醫學科研中心；Taq Plus DNA Polymerase(含預混Mg2+的10倍PCR緩沖液)購自天根生化科技(北京)有限公司，真菌ITS通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)與ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)由上海生工合成。

2 方法

2.1 昆蟲病原真菌的分離

2011年9月從山東臨沂市平邑縣的金銀花基地的12株金銀花上，分別采到12批被真菌感染致死的鱗翅目幼蟲，12批幼蟲編號為SD1～SD12。在顯微鏡下觀察，所有受真菌感染死亡的幼蟲癥狀一致，表面所著生的真菌孢子顏色、形態也一致，因此從每批染病幼蟲中選一頭進行病原真菌分離。用無菌水沖洗僵蟲表面獲得真菌孢子液，血球計數板計數，將孢子液濃度稀釋成1×104孢子/mL，取10 μL接種到PPDA平板中央并均勻涂布。平板置于25 ℃的真菌培養箱中，自然光照培養，待真菌長出后，將形態不同的菌落挑到新的平板上接種純化，直至獲得單一菌落。

2.2 昆蟲病原真菌的形態鑒定

將分離到的病原菌接種到PPDA培養基上，觀察菌落特征，待其開始產孢時，挑取產孢菌絲，在顯微鏡下觀察，根據真菌菌落特征、孢子形態及孢子發生方式進行形態鑒定。

2.3 昆蟲病原真菌的分子鑒定

2.3.1 菌絲體制備與DNA提取 分離到的病原菌接種到PPDA試管斜面上，25 ℃恒溫培養2周后，長出大量橄欖綠色的孢子。向試管中注入1 mL滅菌1%吐溫80溶液，振蕩使孢子懸浮，將孢子懸浮液倒入含40 mL SDY液體培養基的三角瓶中，25 ℃、140 r·min-1搖瓶培養72 h。取8 mL菌液于10 mL離心管中，10 000 r·min-1離心10 min，去上清，用滅菌濾紙吸去菌絲沉淀上的培養液，加液氮研磨菌絲，根據Fungal DNA mini Kit試劑盒的說明書提取真菌DNA，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。

2.3.2 ITS序列擴增、測序及序列分析 50 μL PCR反應體系包含：10 μmol·L-1的ITS4、ITS5引物各2 μL，10 mmol·L-1的dNTP 1 μL，2.5 U/μLTaqDNA聚合酶1 μL，10倍上樣緩沖液5 μL，100 ng·μL-1SD3菌株的DNA模板1 μL，滅菌雙蒸水38 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃補平5 min，4℃終止反應。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得清晰的單一條帶，送交中國農業科學院作物科學研究所重大科學工程開放實驗室進行雙向測序，測序結果在NCBI上進行比對，以確定昆蟲病原菌的分類地位。

3 結果與分析

3.1 病原真菌的分離

從金銀花植株上采集的鱗翅目幼蟲，蟲體上已經布滿白色的菌絲和綠色的孢子。

A.金銀花上的棉鈴蟲僵蟲；B.金銀花尺蠖僵蟲；C.病原菌菌落正面；D.病原菌菌落背面圖1 僵蟲與病原菌菌落形態

用無菌水從蟲體上沖洗真菌孢子，涂布PPDA平板培養，只長出一種菌落形態的真菌，取其分生孢子接到新的PPDA培養基上，4 d后長出肉眼可見的菌落，菌落呈白色、潮濕，隨著菌絲的生長和菌落的擴大，菌落逐漸變得干燥，并從中間向外形成放射狀的溝紋或環狀的波紋，菌落背面呈紅褐色，有皺裂。培養兩周左右，在菌落中部呈環狀產生綠色的孢子，并逐漸朝內、外蔓延，最終整個菌落由白色變為橄欖綠色。從12份僵蟲上分離的真菌菌落形態一致。

3.2 昆蟲病原真菌的鑒定

如圖2，顯微鏡下觀察，真菌孢子呈橄欖綠色、廣橢圓形，分生孢子梗長出成輪的小梗，短圓形，小梗上著生瓶狀體，甁狀體上產生成串的分生孢子。根據病原菌感染昆蟲的病癥、菌落的特征、分生孢子形態及其發生方式，依據《昆蟲病理學》[9]對昆蟲病原真菌的描述，初步將分離到的昆蟲病原真菌鑒定為萊氏野村菌Nomurearileyi。

A.分生孢子梗；B.分生孢子小梗上著生的瓶狀體；C.分生孢子；D.萊氏野村菌形態(《昆蟲病理學》1994)圖2 昆蟲病原菌形態特征

形態觀察發現，從12份僵蟲中分離出的真菌形態特征一致。選取編號SD3的菌株作為代表進行分子鑒定，ITS擴增片段測序后獲得555 bp的序列。在NCBI網站進行序列比對，與SD3的ITS序列同源性最高的15株菌均為萊氏野村菌Nomuraearileyi，同源性為99%～100%。選SD3與10株萊氏野村菌及ITS序列同源性較高的普可尼亞屬Pochonia、綠僵菌屬Metarhizium、蟲草屬Cordyceps真菌各1株的ITS序列，利用MEGA5軟件的NJ法構建系統發育樹，結果如圖3，SD3與萊氏野村菌的關系最為密切，與形態鑒定的結果一致，因此可將感染金銀花尺蠖及棉鈴蟲的病原真菌確定為萊氏野村菌Nomuraearileyi。

圖3 基于菌株SD3 rDNA ITS序列的系統發育樹

4 討論

昆蟲病原真菌是進行害蟲生物防治的重要資源，包括大約100屬、800多種真菌[10]，近年來昆蟲病原真菌的研究受到越來越多的關注，其中綠僵菌Metarhizium已經在非洲、澳大利亞被成功大面積應用于防治蝗蟲，我國也在草原上開展利用綠僵菌防治草原蝗蟲的研究[11]。相比大量在草業、林業、衛生以及糧食作物生產領域開展的利用昆蟲病原真菌進行害蟲生物防治的研究，鮮有利用昆蟲病原真菌防治藥材害蟲的報道，隨著綠色藥材生產理念的發展，有必要探索研究既能夠減少甚至替代化學農藥使用，又能保證藥材生產的新型真菌殺蟲劑。萊氏野村菌能寄生多種鱗翅目害蟲，對夜蛾科(如棉鈴蟲、大豆夜蛾、黎豆夜蛾、粉紋夜蛾、斜紋夜蛾等)害蟲的致病力很強，且能夠在田間引起疾病流行[9]，具有較高的應用潛力和研究價值。萊氏野村菌的有效成分為分生孢子，其生產需要苛刻的營養和持續光照條件，限制了大規模生產，因此，在大量收集、篩選具有高毒力的萊氏野村菌菌株的同時，應該加強其孢子發酵生產的工藝研究。微菌核(microsclerotium)是萊氏野村菌的一種抗逆性極強的休眠結構，由特化的菌絲纏繞而成，可以抵御不良環境，有可能作為一種替代分生孢子的有效成分[12]。真菌殺蟲劑的使用效果容易受到環境濕度、溫度、光照等因素的影響，因此，只有開發出合適的制劑，并選擇恰當的時間，在環境條件合適的區域合理地使用才可能取得理想的防治效果。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：205.

[2] 王廣軍，張國彥，王江蓉.金銀花尺蠖的發生規律與防治技術[J].中國植保導刊，2005.25(003)：22-23.

[3] 任應黨，劉玉霞，申效誠，等.金銀花主要害蟲及防治[J].河南農業科學，2004(09)：66-68.

[4] Thomas M B，Read A F.Can fungal biopesticides control malaria?[J].Nature Reviews Microbiology，2007，5(5)：377-383.

[5] Scholte E J，Knols B G J，Takken W.InfectionofthemalariamosquitoAnophelesgambiaewiththeentomopathogenicfungusMetarhiziumanisopliaereduces blood feeding and fecundity[J].Journal of invertebrate pathology，2006，91(1)：43-49.

[6] Peng G，Wang Z，Yin Y，et al.FieldtrialsofMetarhiziumanisopliaevar.acridum(Ascomycota：Hypocreales)againstorientalmigratorylocusts，Locustamigratoriamanilensis(Meyen)in Northern China[J].Crop Protection，2008，27(9)：1244-1250.

[7] 丁福章，張澤華，張禮生，等.綠僵茵對椰心葉甲的控制作用研究[J].西南農業大學學報(自然科學版)，2006，28(3).

[8] 王濱，李增智，姚劍.真菌殺蟲劑產業的發展現狀·趨勢與對策[J].安徽農業科學，2010(012)：6269-6270..

[9] 蒲蟄龍.昆蟲病理學[M].廣州：廣東科技出版社，1994：368-373.

[10] 李增智.蟲生真菌在害蟲治理中應用現狀[J].安徽農學院學報，1987.14(2)：59-66.

[11] St.Leger R J，Wang C S.Genetic engineering of fungal biocontrol agents to achieve greater efficacy against insect pests[J].Applied microbiology and biotechnology，2010.85(4)：901-907.

[12] 姜莎莎.RacA與Cdc42調節雙型真菌萊氏野村菌的極性生長和微菌核形成[D].重慶大學，2014.

Identification of Entomopathogenic Fungi fromHeterolochajinyinhuaphagaandHelicoverpaarmigeraDamagingLonicerajaponicaThunb

MA Weisi1,2，XU Changqing1，ZHANG Jinliang3，Dong Jie3，QIAO Haili1，GUO Kun1，XU Rong1，CHEN Jun1，ZHANG Dayong4

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agriculture，Kunming 650205，China；3 Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029，China；4.Department of Plant Resources of The JDB Group，Beijing 100176，China)

Objective：To identify the entomopathogenic fungi which killingHeterolochajinyinhuaphagaandHelicoverpaarmigeradamagingLonicerajaponicaThunb.Methods：Eleven samples ofHeterolochajinyinhuaphagaand one sample ofHelicoverpaarmigeralepidoptera larvae infected by entomopathogenic fungi were collected fromLonicerajaponicaThunb，twelve entomopathogenic fungi strains were isolated by culturing spores washing from dead larvae，these fungi were identified with morphological characteristic and rDNA ITS sequence.Results：All strains of fungi were identified asNomurearileyi.Conclusion：Nomurearileyiis one kind of entomopathogenic fungus that could kill some kind of lepidoptera larvae on the medicinal plant ofLonicerajaponicaThunb，it will be useful research materials for study to control insects ofLonicerajaponicaThunb and other medicinal plants.

LonicerajaponicaThunb；Heterolochajinyinhuaphaga；Helicoverpaarmigera；Nomurearileyi

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.013

2015-02-25)

國家自然科學基金(81102745)；北京市農業局項目(PXM2014-036203-000007)

*

陳君，研究員，研究方向：藥用植物栽培與保護；Tel：(010)57833352，E-mail：junzichen@263.net