內生真菌Trichoderma harzianum次生代謝產物研究△

呂海寧，陳輝，屈晶，李勇，馬雙剛，劉云寶

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

·基礎研究·

內生真菌Trichoderma harzianum次生代謝產物研究△

呂海寧，陳輝，屈晶，李勇，馬雙剛，劉云寶*

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

目的：對格木ErythrophleumfordiiOliver的內生真菌菌株Trichodermaharzianum次生代謝產物進行研究。方法：將此內生真菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，對其發(fā)酵液利用色譜方法進行分離純化，利用波譜方法鑒定得到化合物結構。結果：從其發(fā)酵液中分離得到了10個化合物，包括7個環(huán)二肽類、2個酚酸和1個嘧啶類化合物，其結構分別為環(huán)(R-脯氨酸-甘氨酸)(1)、環(huán)-(R-脯氨酸-R-丙氨酸)(2)、環(huán)-(S-脯氨酸-R-纈氨酸)(3)、環(huán)-(4-甲基-R-脯氨酸-S-正纈氨酸)(4)、環(huán)-(R-脯氨酸-R-亮氨酸)(5)、環(huán)-(R-脯氨酸-R-苯丙氨酸)(6)、環(huán)-(4-羥基-S-脯氨酸-S-亮氨酸)(7)、尿嘧啶(8)、對羥基苯乙醇(9)、間羥基苯乙酸(10)。結論：這些化合物均是首次從該菌株中分離得到。

格木；內生真菌Trichodermaharzianum；次生代謝產物

內生真菌廣泛分布于植物體內，并與之產生共生關系。其次生代謝產物與宿主植物次生代謝產物有一定的相似性，但同時也存在特異性，含有多種結構新穎的生物活性物質，是一種重要的藥用植物替代或新的藥用資源庫。本課題組曾對廣西產豆科格木屬植物格木ErythrophleumfordiiOliver的莖皮進行了系統(tǒng)的化學成分研究，從中分離得到8個具有細胞毒活性的卡薩因型二萜生物堿[1]。從格木莖皮分離得到的一株內生真菌，由中國科學院微生物研究所鑒定為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。細胞毒活性(MTT)篩選結果表明Trichodermaharzianum菌株的發(fā)酵液95%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取部位具有一定的體外抗腫瘤活性。因此，本實驗對此活性部位的次生代謝產物進行化學成分研究，從中分離鑒定了10個化合物，包括7個環(huán)二肽類、2個酚酸和1個嘧啶類化合物，化合物的結構見圖1。

圖1 化合物1～10的結構

1 儀器和材料

1.1 儀器

XGYU型高壓滅菌鍋(上海嘉展儀器設備有限公司)；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL型質譜儀；Mercury-400；Inova 500 M；Bruker AVIIIHD 500型核磁共振儀；高效液相色譜儀(日本島津公司)；P2000型旋光儀(日本Jasco公司)；Hitachi UV-240型紫外光譜儀(日本日立公司)；YMC-Pack ODS-A制備型反相色譜柱、YMC-C18分析型反相色譜柱(日本YMC公司)；反相硅膠、Rp-C18(日本Fuji Silysia公司)；Sephadex LH-20(Amershan Pharmacia Biotech AB)；分析純溶劑(北京化工廠)；色譜純溶劑[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 材料

本實驗所研究的菌株是從廣西產格木屬植物格木ErythrophleumfordiiOliver的莖皮中分離，并由中國科學院微生物研究所鑒定為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基為GPY培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀(KH2PO4)3 g、硫酸鎂(MgSO4)1.5 g、葡萄糖20 g、酵母浸膏6 g、蛋白胨6 g、水1000 mL。調節(jié)pH值至6.0，培養(yǎng)基于120 ～122 ℃，蒸汽滅菌30 min。

2 提取和分離

將經過活化的內生真菌斜面菌種接種于400 mL的GPY液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、130 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)3 d，再取生長良好的菌體培養(yǎng)液轉接于發(fā)酵罐中，進行放大發(fā)酵，于25 ℃發(fā)酵3 d，共發(fā)酵300 L。

收集糊狀發(fā)酵物，用紗布過濾分離菌絲體與菌液，菌絲體用95%乙醇浸泡數(shù)天，紗布過濾，濾液與菌液合并后上大孔吸附樹脂柱，分別用水和95%乙醇水溶液洗脫，95%乙醇水溶液洗脫液經減壓濃縮得稠膏850 g。用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮干燥，得乙酸乙酯可溶物80 g。乙酸乙酯可溶物進行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，得5個組分，其中二氯甲烷-甲醇(50∶1)洗脫部分經Sephadex LH-20柱色譜(CH3OH洗脫)純化去除色素，再經HPLC(乙腈-水)制備，得化合物2(171 mg)、3(60 mg)、5(180 mg)和7(63 mg)；二氯甲烷-甲醇-(30∶1)洗脫部分同樣處理后，經HPLC制備，得化合物9(140 mg)和10(34 mg)；二氯甲烷-甲醇(20∶1)洗脫部分經同樣處理后，經HPLC制備，得化合物1(70 mg)和6(26 mg)；二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫部分經同樣處理后，經HPLC制備，得化合物4(100 mg)和8(140 mg)。

3 結構鑒定

化合物8：黃色粉末；ESI-MSm/z：113.1 [M+H]+。1H-NMR(500 MHz，D2O)δ：7.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，5.91(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C-NMR(125 MHz，D2O)δ：170.3(C-4)，156.0(C-2)，146.3(C-6)，103.9(C-5)。以上數(shù)據與文獻[8]報道一致，故確定其為尿嘧啶。

化合物9：白色粉末；FeCl3顯色反應呈陽性，說明含有酚羥基；ESI-MSm/z：161.3 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.02(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，6.73(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，3.63(2H，t，J=5.0 Hz，H-8)，2.65(2H，t，J=5.0 Hz，H-7)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：157.0(C-4)，131.3(C-1)，131.1(C-2，6)，116.4(C-3，5)，64.9(C-8)，39.7(C-7)。以上數(shù)據與文獻[9]報道一致，故確定其為對羥基苯乙醇。

化合物10：白色粉末；FeCl3顯色反應呈陽性，說明含有酚羥基；ESI-MSm/z：175.1 [M+Na]+。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.00(2H，m，H-2，5)，6.70(1H，overlap，H-4)，6.69(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，3.51(2H，s，H-7)；13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：176.5(C-8)，157.0(C-3)，132.3(C-5)，129.5(C-6)，123.1(C-1)，120.7(C-2)，116.4(C-4)，36.8(C-7)。以上數(shù)據與文獻報道[10]一致，故確定其為間羥基苯乙酸。

4 結論

對從格木莖皮中分離的內生真菌Trichodermaharzianum次生代謝產物進行研究，從中分離得到了10個化合物，其中包括7個環(huán)二肽類、2個酚酸和1個嘧啶類化合物，這些化合物均是首次從該菌株中分離得到。

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StudyonsecondarymetabolitesofendophyticfungiTrichodermaharzianumLYUHaining，CHENHui，QUJing，LIYong，MAShuanggang，LIUYunbao*

Objective：The secondary metabolites of endophytic fungusTrichodermaharzianum，isolated fromErythrophleumfordiiOliver，were studied.Methods：The endophytic fungus was fermented and the chemical constituents were isolated and purified by various column chromatographies.The structures of isolated compounds were determined by combined spectroscopic methods.Results：10 compounds including 7 cyclic dipeptides，2 phenols and 1 prydine were isolated.Their structures were determined respectively as cyclo-(R-Pro-Gly)(1)，cyclo-(R-Pro-R-Ala)(2)，cyclo-(S-Pro-R-Val)(3)，cyclo-(4-methyl-R-Pro-S-Nva)(4)，cyclo-(R-Pro-R-Leu)(5)，cyclo-(R-Pro-R-Phe)(6)，cyclo-(4-hydroxyl-S-Pro-S-Leu)(7)，uracil(8)，p-hydroxylphenylethanol(9)，m-hydroxylphenylacitic acid(10).Conclusion：All these compounds were isolated fromTrichodermaharzianumfor the first time.

ErythrophleumfordiiOliver；Endophytic fungiTrichodermaharzianum；secondary metabolites

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines，InstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100050，China)

2015-02-11)

國家自然科學基金(21132009，81202432)

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劉云寶，副研究員，研究方向：活性天然產物的化學及活性研究；E-mail：liuyunbao@imm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.004