人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及分析△

呂靜，李珂珂，李爭寧，弓曉杰*，陳麗榮，魏漢蓮

(1.大連大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622；3.遼寧政法職業學院 食品藥品安全系，遼寧 沈陽 110161)

·基礎研究·

人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及分析△

呂靜1，李珂珂2，李爭寧1，弓曉杰2*，陳麗榮1，魏漢蓮3

(1.大連大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622；3.遼寧政法職業學院 食品藥品安全系，遼寧 沈陽 110161)

目的：研究人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成及產物結構，建立其高效液相分析方法。方法：采用對葡萄糖基6-位保護-去保護的方法，得到除糖基6-位未乙酰化的化合物K衍生物1c；利用一維核磁(1D NMR)、二維核磁(2D NMR)及質譜(MS)方法對合成產物1c進行結構鑒定；利用反相高效液相色譜，建立了人參皂苷化合物K乙酰化衍生物1c的分析方法。結果：人參皂苷化合物K乙酰化產物1c的得率為46.4%，在高效液相色譜中與其他雜質的分離度較好，分析時間在45 min以內。結論：首次采用人參皂苷化合物K葡萄糖基6-羥基保護的路線，合成其乙酰化衍生物1c，并歸屬了衍生物的NMR數據。采用HPLC可以快速高效地進行人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的分析。

人參皂苷化合物K；乙酰化；高效液相

人參作為一種傳統中藥，在中國、韓國、日本等被廣泛應用，其主要活性成分是人參皂苷。人參皂苷具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病等[1-2]。近年來，人參皂苷化合物K由于獨特的生物活性引起了廣泛關注，其為口服人參后腸道菌群代謝的主要產物之一，能夠抑制人結腸癌及肝癌細胞增殖，并誘導其凋亡[3-4]，具有較好的抗炎作用[5]。20世紀日本學者研究發現，腸道菌群的代謝物化合物K及其脂肪酸酯類化合物是人參發揮實際藥效的成分[6-8]。眾多學者針對這一理論，開展了合成人參皂苷衍生物的研究[9-10]，從而改善分子結構，提高其活性作用。目前，通過選擇性保護策略，合成了多種化合物K的酯化產物，與底物相比，其抗腫瘤作用顯著提高[11-13]。

本文采用選擇性保護-去保護的策略，合成了除葡萄糖基6-位外的全乙酰化產物，利用NMR對其結構做了詳細表征，并通過反相高效液相色譜法，定性分析了終產物的構成，為化合物K的結構修飾和產物分析提供了新思路。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(分析型Agilent 1260)；制備型LC 3000(北京創新通恒科技有限公司)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；ETS-D4加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；核磁共振儀Bruker AVANCE DRX-500型(Bruke公司，1H-NMR 400 MHz/13C-NMR 100 MHz，TMS內標)；LC-MS-2010EV電噴霧離子肼質譜儀(日本Shimadzu)。

1.2 試劑

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、三乙胺、氯化銨、乙酸酐、四氫呋喃、碳酸氫鈉、無水亞硫酸鈉、叔丁基二苯基氯硅烷、四丁基氟化銨(分析純，中國化工集團)；甲醇(色譜純，美國TEDIA)；水為超純水。

1.3 材料

人參皂苷化合物K(大連富生天然藥物有限公司，批號：20100321)經NMR及MS測定純度為98%；硅膠(200-300目，青島海洋化工廠)。

2 方法和結果

2.1 衍生物的合成

2.1.1 化合物K葡萄糖基6-羥基的保護 在裝有電磁攪拌器的25 mL休良克瓶中，加入化合物K 100 mg(0.160 5 mmol)(1)，用1 mL三乙胺溶解，氮氣保護，冰水浴下加入叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)210 μL(0.802 7 mmol)，反應10 min后，升至室溫，薄層色譜法監測反應進程。12 h反應完畢后，加入飽和氯化銨溶液停止反應。反應產物用二氯甲烷萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有機相，無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥，濃縮溶劑，柱層析純化(甲醇-二氯甲烷洗脫)后得到產物1a125 mg。

2.1.2 化合物K羥基乙酰化 在裝有電磁攪拌器的25 mL休良克瓶中，加入100 mg(0.116 1 mmol)化合物K的葡萄糖基6-羥基的保護產物1a和0.7 mg(0.005 8 mmol)4-二甲氨基吡啶，用2 mL三乙胺溶解，氮氣保護，冰水浴下加入乙酸酐219 μL(2.322 mmol)，反應10 min后，升至室溫，薄層色譜法監測反應進程，24 h反應完畢后，加入飽和碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液停止反應。反應產物用二氯甲烷萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有機相，無水Na2SO4干燥，濃縮溶劑，柱色譜純化(乙酸乙酯-石油醚洗脫)后得到產物1b101 mg。

圖1 人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的合成路線

2.1.3 化合物K乙酰化衍生物的合成 將65 mg上述人參皂苷化合物K的硅醚全乙酰化產物1b65 mg(0.060 7 mmol)，加入到50 mL的圓底燒瓶中，用2 mL無水四氫呋喃溶解，冰水浴下加入四丁基氟化銨(TBAF)18 μL(0.060 7 mmol)，反應30 min后升至室溫，薄層色譜檢測反應進程。反應8 h后完成，減壓濃縮除掉四氫呋喃，加入等體積乙酸乙酯和水共2 mL溶解。反應產物用乙酸乙酯萃取(每次5 mL，共3次)，Brine洗有機相，無水Na2SO4干燥，濃縮溶劑，柱色譜純化(乙酸乙酯-石油醚洗脫)后得到化合物K乙酰化衍生物1c32 mg。合成路線圖見圖1。

2.2 化合物K乙酰化衍生物的結構解析

1a：乳白色粉末。ESI-MS：m/z883.5501(C52H80NaO8Si [M+Na]+；計算值883.5520)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：7.68(4H，m)，7.39(6H，m)，4.53(1H，d，J=6.1 Hz，H-glc-1)，5.11(1H，t，J=5.7 Hz，H-24)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：苯環上碳，135.5(2個C)、133.1(4個C)、129.6(4個C)、127.7(2個C)；131.2(C-25)；124.7(C-24)；96.9(C-glc-1)；73.4(C-glc-2)；78.8(C-glc-3)；71.1(C-glc-4)；75.6(C-glc-5)；64.3(C-glc-6)。

1b：乳白色粉末。ESI-MS：m/z1093.6042(C62H90NaO13Si [M+Na]+；計算值1093.6048)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：4.50(1H，d，J=7.8 Hz，H-glc-1)，5.14(1H，t，J=7.7 Hz，H-24)，7.66(4H，m)，7.37(6H，m)；13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：苯環上碳，135.7(2個C)、133.2(4個C)、129.7(4個C)、127.7(2個C)；131.3(C-25)；124.6(C-24)；94.7(C-glc-1)；73.8(C-glc-2)；75.3(C-glc-3)；68.8(C-glc-4)；74.4(C-glc-5)；62.8(C-glc-6)。

1c：乳白色粉末。ESI-MS：m/z855.4864(C46H72NaO13[M+Na]+；計算值 855.4871)。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)和13C-NMR(CDCl3，100 MHz)。見表1。

表1 人參皂苷化合物K乙酰化衍生物1c的1H和13C-NMR數據(400 MHz in CDCl3)

注：COOCH3中甲基的1H和13C-NMR信號重疊嚴重，較難歸屬連接位置，δC20.7(δH2.08)，δC20.8(δH2.07)，δC20.8(δH2.05)，δC21.3(δH2.03)，δC21.8(δH1.97)。

2.3 化合物K乙酰化衍生物1c高效液相色譜條件的確定

2.3.1 色譜柱的選擇 分別采用Agilent C18不同長度及型號的色譜柱進行合成產物的分離試驗。綜合結果，本試驗選用Zorbax Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，可以達到較好的色譜分離效果。

2.3.2 檢測波長的選擇 產物1c采用DAD檢測器進行，190 ～ 400 nm檢測時，發現在203 nm下有最大吸收[14]。因而采用203 nm作為檢測波長。

2.3.3 流動相的選擇 根據產物1c的結構特征，在乙腈-水體系和甲醇-水體系之間進行了篩選。從分離度和峰形來看，70%乙腈-水體系較適合作為分離含有1c的合成產物的流動相。

2.3.4 柱溫的選擇 考查了不同溫度下的衍生物分離度，結果發現，柱溫為25 ℃時分離效果較好。

2.4 化合物K乙酰化衍生物1c高效液相色譜分析

將上述2.1.3合成的終產物，在未經硅膠柱色譜純化時制備成質量濃度為5.0 mg·mL-1的甲醇溶液，利用高效液相色譜分析其產物情況。終產物經0.45 μm微孔濾膜過濾后，采用2.3的色譜條件，進樣10 μL，得到了含1c合成產物色譜圖，見圖2。

圖2 人參皂苷化合物K乙酰化衍生物的液相色譜圖

從色譜圖中可以看出，脫保護基后的產物有6個，其中第4號出峰即為目標產物1c。根據峰面積百分比計算法，其占產物含量的23.5%。見表2。

2.5 化合物K乙酰化衍生物1c合成產率的計算

投入人參皂苷化合物K 100 mg，分離純化后得到1a125 mg，可以得出第一步反應的產率為90.4%。第二步乙酰化反應投入1a100 mg，分離純化后得到目標產物1b101 mg，產率為81.4%。最后脫保護基的反應投入1b65 mg，分離純化后得到乙酰化產物1c32 mg，脫保護反應產率為63%。綜合以上3步反應，合成化合物K乙酰化衍生物1c的總得率為46.4%。

表2 人參皂苷化合物K乙酰化衍生物合成產物的出峰時間及相應峰面積百分比

3 討論

本論文為了達到選擇性保護伯羥基的目的，設計了使用硅烷保護基保護的方案，流程為保護-全乙酰化-脫保護。該方法反應條件溫和，選擇性好，反應底物無毒性，大大地降低了分離的難度，為后續試驗提供方法和依據。

產物1c的5個乙酰基中各個甲基的氫譜和碳譜數據通過異核單量子相干相關譜(HSQC)得到了較好的指認，但其取代位置由于信號重疊嚴重，在異核多鍵相關譜(HMBC)中較難歸屬清楚，因此未指定具體連接位置。

綜上，本文通過對葡萄糖基6-位選擇性保護的策略，首次高效率地合成了化合物K乙酰化衍生物，并通過NMR詳細歸屬了其氫譜和碳譜數據。利用HPLC對終產物的組成進行了定性分析，建立的分析方法可以用于目標產物的分離純化。本文在終產物的純化中利用了硅膠柱色譜，在今后大量制備中，為減小損失量并提高純度，可以參考此方法用于HPLC制備分離。

[1] Choi K T.Botanical characteristics，pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng C.A.Meyer [J].Acta Pharmacol Sin，2012，29(9)：1109-1118.

[2] Sathishkumar N，Sathiyamoorthy S，Ramya M，et al.Molecular docking studies of anti-apoptotic BCL-2，BCL-XL，and MCL-1proteins with ginsenosides from Panax ginseng [J].J Enzyme Inhib and Med Chem，2012，27(5)：685-692.

[3] Oh S H，Lee B H.A ginseng saponin metabolite-induced apoptosis in HepG2 cells involves a mitochondria-mediatedpathway and its downstream caspase-8 activation and Bid cleavage [J].Toxicol Appl Pharmacol，2004，194(3)：221-229.

[4] Zhang Z，Du G J，Wang C Z，et al.Compound K，a ginsenoside metabolite，inhibits colon cancer growth via multiple pathways including p53-p21 interactions [J].Inter J Mol Sci，2013，14(2)：2980-2995.

[5] Joh E H，Lee I A，Jung I H，et al.Ginsenoside Rb1and its metabolite compound K inhibit IRAK-1 activation-The key ste Pof inflammation [J].Biochem Pharmacol，2011，82(3)：278-286.

[6] Hasegawa H，Lee K S，Nagaoga T，et al.Pharmacokinetics of ginsenoside deglycosylated by intestinal bacterial and its transformation to biologically active fatty esters [J].Biol Pharm Bull，2000，23(3)：298-304.

[7] Hasegawa H，Suzuki R，Nagaoka T，et al.Prevention of growth and metastasis of murine melanoma through enhanced natural-killer cytotoxicity by fatty acid-conjugate of protopanaxatriol [J].Biol Pharm Bull，2002，25(7)：861-866.

[8] Hasegawa H.Proof of the mysterious efficacy of ginseng：basic and clinical trials：metabolic activation of ginsenoside：deglycosylation by intestinal bacteria and esterification with fatty acid [J].J Pharmacol Sci，2004，95(2)：153-157.

[9] Liu J H，Chen D K，Liu P，et al.Discovery，synthesis，and structure-activity relationships of 20(S)-protopanaxadiol(PPD)derivatives as a novel class of AMPKα2β1γ1 activators [J].Eur J Med Chem，2014，79：340-349.

[10] Mathiyalagan R，Subramaniyam S，Kim Y J，et al.Ginsenoside compound K-bearing glycol chitosan conjugates：Synthesis，physicochemical characterization and in vitro biologicalstudies [J].Carbohydr Polym，2014，112：359-366.

[11] Li W F，Li Z N，Chen L R，et al.Synthesis and structural analysis of mono-dodecanoic acid esters of ginsenoside M1[J].Chin J Nat Med，2011，9(3)：199-203.

[12] Li W F，Chen L R，Gong X J，et al.Synthesis of esters of ginsenoside metabolite M1 and their cytotoxicity on MGC80-3 cells[J].Molecules，2013，18(4)：3689- 3702.

[13] 肖景楠，李珂珂，李爭寧，等.人參皂苷M1異丁酸酯衍生物的合成及高效液相分析和制備[J].中國現代中藥，2014，16(5)：368-372.

[14] 鄭長龍，魚紅閃，金鳳燮.人參稀有皂苷C-K的分離與純化[J].大連工業大學學報，2003，22(3)：167-169.

SynthesisofginsenosidecompoundKacetylatedderivativeandHPLCanalysis

LYUJing1，LIKeke2，LIZhengning1，GONGXiaojie2*，CHENLirong1，WEIHanlian3

(1.CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering，DalianUniversity，Dalian116622，China；2.CollegeofMedical，DalianUniversity，Dalian116622，China；3.Department of food and drug safty，Liaoning vocational college of political science and law，Shenyang110161，China)

Objective：To synthesize and structural analyze ginsenoside compound K acetylated derivative，and establish a HPLC method for the derivative.Methods：Using the protection-deprotection strategy on the 6-OH of glucosyl，ginsenoside compound K derivatives 1c was synthesized with acetylated except 6-OH of glucosyl，and the structure of 1c was identified by 1D NMR，2D NMR and MS.The analysis method of the end-product was established by RP-HPLC-DAD，and optimized.Results：Taking all the three steps of the synthesis of 1c into account，the yield was 46.4%.In the end-product，1c showed good separation with other impurity substances，the analysis time of 1c was less than 45 minutes.Conclusion：Using the protection strategy on the 6-OH of glucosyl，we synthesized compound K acetylated derivatives for the first time，and provided the comprehensive NMR data.The HPLC method can provide a rapid and efficient method to determination of the end-product.

Ginsenoside compound K；acetylated；HPLC

2015-04-10)

國家自然科學基金(81172949)；遼寧省教育廳科學技術研究一般研究項目(L2012439)；遼寧省優秀人才支持計劃(LR2013058)；遼寧省科技廳科學技術計劃項目(2014204007)；大連市科技局科技計劃項目(2014E12SF071)

*

弓曉杰，教授，碩士生導師，研究方向：中藥新藥開發；E-mail：gxjclr@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.005