雪菊總黃酮抗氧化活性研究△

邱佳俊，高飛，李雅麗，劉江云，木胡牙提·烏拉斯?jié)h，郝麗莉，楊世林

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 VIP內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 綜合心臟內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011)

·基礎(chǔ)研究·

雪菊總黃酮抗氧化活性研究△

邱佳俊1，高飛1，李雅麗2*，劉江云1，木胡牙提·烏拉斯?jié)h3，郝麗莉1，楊世林1

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 VIP內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 綜合心臟內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：研究雪菊總黃酮及其主要成分的抗氧化活性。方法：對雪菊總黃酮的主成分進行分離鑒定和含量測定，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法測試其抗氧化活性。結(jié)果：分離鑒定了雪菊總黃酮中的黃諾瑪苷、馬里苷2個主成分，雪菊總黃酮對DPPH、ABTS自由基的半數(shù)清除率依次為11.06、139.3 μg·mL-1，與馬里苷、黃諾瑪苷的半數(shù)清除率相近。結(jié)論：雪菊精制總黃酮具有優(yōu)良的抗氧化能力，其中主要含有馬里苷、黃諾瑪苷等黃酮類活性成分。

兩色金雞菊；抗氧化；馬里苷；黃諾瑪苷

菊科植物兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.原產(chǎn)北美，花色艷麗，作為觀賞植物在全球多地均有分布。該植物全草稱為蛇目菊，具有清熱解毒、化濕止痢的功能。在20世紀(jì)80年代，新疆和田等地將其作為一種特色花茶飲用，俗稱雪菊、血菊、金雞菊，維語稱為“古里恰依”，具有預(yù)防心血管疾病的功能[1]。近年來，有研究表明，雪菊具有較為明確的降血糖[2-4]、降血壓[5-6]、降脂[7]、抗氧化[8-9]等作用。隨著人們對雪菊功能認(rèn)識的加深，該藥材被譽為與天山雪蓮齊名的新疆特產(chǎn)，并已在新疆多地區(qū)進行規(guī)?；N植和推廣。

雪菊中的主要化學(xué)成分為黃酮類物質(zhì)[3，9-12]，包括馬里苷、奧卡寧、黃諾瑪苷等。近年來對雪菊的化學(xué)成分及藥理活性方面已有較多報道，但未見對其總黃酮及各單體成分的含量分析和相應(yīng)抗氧化活性的研究。本課題組以雪菊總黃酮及其主要成分為研究對象，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和2,2-聯(lián)氮-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法評價雪菊總黃酮及2種主要成分的抗氧化能力，為雪菊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

雪菊藥材(批號：20130510)購自新疆達坂城，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定為菊科兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.的花蕾。

黃諾瑪苷、馬里苷對照品(實驗室自制，純度分別為93.2%、97.1%)；蘆丁對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號：100080-200306，純度為91.7%)；1，6-雙(二苯基膦基)己烷(DPPH，批號：D0908)和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，批號：A2166)購自日本東京化成工業(yè)株式會社；AB-8、LX2000大孔吸附樹脂(西安藍曉科技有限公司)；十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)填料(75 μm，日本Cosmosil公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；色譜用純凈水(杭州娃哈哈公司)；乙醇、甲醇等試劑(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，包括1260 Infinity VL 型四元泵、1260 DAD VL紫外檢測器、1260 TCC柱溫箱、LC-Solution色譜工作站(美國Agilent 公司)；ODS色譜柱(5C18-AR-II，日本Cosmosil公司)；Agilent-6100型LCMS系統(tǒng)；Avance III plus 400 MHz核磁共振儀(德國Bruker Daltonics公司)；UV-SPD-M20A紫外分光光度計(日本島津公司)；ME215S型電子天平(德國Starorious公司)。

2 方法

2.1 雪菊總黃酮的制備

稱取干燥雪菊藥材1.0 kg，加入12倍量75%乙醇回流提取2次，每次60 min，減壓濃縮至2.2 L，溶液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱(100 cm×10 cm，柱體積2 L)吸附后，依次用水(12 L)、10%乙醇(6 L)、75%乙醇(8 L)、95%乙醇(4 L)洗脫，75%乙醇洗脫部分減壓濃縮干燥，即得雪菊總黃酮(CTFE，114.9 g)提取物。

2.2 黃諾瑪苷和馬里苷的分離與鑒定

稱取CTFE1.0 g，經(jīng)LX2000小孔樹脂柱(柱體積50 mL)吸附，依次用水(300 mL)、30%、50%、75%甲醇、純甲醇各250 mL洗脫。其中30%甲醇流分濃縮，溶液上ODS反相硅膠柱，依次用15%、20%、25%、30%、75%甲醇各300 mL洗脫，20%和25%洗脫流分經(jīng)HPLC檢測合并，濃縮，經(jīng)Sephadex LH-20柱用甲醇洗脫，濃縮，獲得化合物1(16.1 mg，按HPLC相對峰面積計純度為93.2%)；50%和75%甲醇流分合并濃縮，溶液上ODS反相硅膠柱，依次用30%、40%、50% 、90%甲醇各300 mL洗脫，40%及50%洗脫流分經(jīng)HPLC檢測合并、濃縮，經(jīng)Sephadex LH-20柱用甲醇洗脫，濃縮，獲得化合物2(34.6 mg，按HPLC相對峰面積計純度為97.1%)。

采用HRESIMS[11]、1H-NMR、13C-NMR等波譜技術(shù)，參考相關(guān)文獻，對2個化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，各化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 黃諾瑪苷(1)和馬里苷(2)結(jié)構(gòu)

化合物1：淡黃色粉末，HR-ESI-MS(+)給出準(zhǔn)分子離子m/z473.1051([M+Na]+，計算值473.1054)，相應(yīng)分子式為C21H22O11。UV max(HPLC，16%乙腈-0.1%乙酸溶液)：280 nm。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.18(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.92(1H，br s，H-2′)，6.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，6.76(2H，both d，J=7.8 Hz，H-5′，H-6′)，5.41(1H，dd，J=12.4，2.8 Hz，H-2)，4.92(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)，3.10(1H，overlap，H-3b)，2.69(1H，dd，J=16.8，2.8 Hz，H-3a)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：191.13(C-4)，150.72 和150.62(C-7；C-9)，145.61(C-3′)，145.11(C-4′)，135.15(C-8)，129.86(C-1′)，117.95(C-6′)，116.67(C-5)，115.84(C-10)，115.27(C-5′)，114.45(C-2′)，108.94(C-6)，101.41(C-1″)，79.17(C-2)，77.24(C-3″)，75.71(C-5″)，73.15(C-2″)，69.65(C-4″)，60.60(C-6″)，43.41(C-3)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻[11，13]報道數(shù)據(jù)比較，基本一致，鑒定為異奧卡寧-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(黃諾瑪苷)。

化合物2：橙色粉末，HR-ESI-MS(+)給出準(zhǔn)分子離子m/z535.1076([M+Na]+，計算值535.1093)，相應(yīng)分子式為C24H24O14。UV max(HPLC，16%乙腈-0.1%乙酸溶液)：265，310(sh)，378 nm。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：13.23(1H，s，OH-2′)，7.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′)，7.71(1H，d，J=16.0 Hz，β-H)，7.30(1H，d，J=16.0 Hz，α-H)，7.24(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.82(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，4.92(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：192.68(3-C=O)，152.46(C-2′)，150.56(C-4′)，149.15(C-4)，145.61(β-C)，145.32(C-3)，134.38(C-3′)，126.13(C-1)，122.57(C-6)，121.49(C-6′)，117.46(α-C)，115.98(C-2)，115.74和115.67(C-5；C-1′)，106.53(C-5′)，100.95(C-1″)，77.34(C-3″)，75.85(C-5″)，73.20(C-2″)，69.74(C-4″)，60.65(C-6″)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻[10-11]報道數(shù)據(jù)比較，基本一致，鑒定為奧卡寧-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(馬里苷)。

2.3 液相分析

采用HPLC方法測定黃諾瑪苷和馬里苷含量。液相分析條件：流動相為乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，16% A；20～40min，30% A)；檢測波長為280 nm(黃諾瑪苷)和378 nm(馬里苷)；柱溫為30 °C；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。在優(yōu)化色譜條件下，各相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3500。

2.4 抗氧化活性測定

2.4.1 DPPH法 參考文獻[14]方法進行。取配好的0.04% DPPH乙醇溶液3 mL，加入800 μL各濃度的樣品溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，用分光光度計測定517 nm處吸光度Ai。按下列公式計算各樣品對DPPH·的清除率：

DPPH·清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100%

式中Ai為加入樣品反應(yīng)后溶液的吸光度值，Ab為未加樣品的DPPH.工作液吸光度值。根據(jù)清除率數(shù)據(jù)曲線計算半數(shù)清除率(IC50)。

2.4.2 ABTS法 參考文獻[14]方法進行。將配制好的ABTS溶液與過硫酸鉀(K2S2O8)均勻混合，在室溫下置于暗處過夜。將生成的ABTS·+溶液用乙醇稀釋，使其在30 ℃、734 nm波長下的吸光度為0.70，即得到ABTS·+工作液。在試管中加入3.0 mL的ABTS·+工作液，再加入100 μL的樣品溶液，混勻，放置于暗處，反應(yīng)6 min，在734 nm處測吸光度值A(chǔ)i。按下列公式計算各樣品對ABTS·+的清除率：

ABTS·+清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100%

式中Ai為加入樣品反應(yīng)后溶液的吸光度值，Ab為未加樣品的ABTS·+工作液吸光度值，根據(jù)清除率數(shù)據(jù)曲線計算IC50。

3 結(jié)果

3.1 雪菊總黃酮的成分分析

采用乙醇提取和大孔吸附樹脂純化方法，制備獲得雪菊總黃酮。經(jīng)液相分析，并與文獻[3，9，12]對比，推測雪菊總黃酮中主要成分為黃諾瑪苷和馬里苷。經(jīng)進一步分離純化，獲得該2個主成分對照品，并經(jīng)高分辨電噴霧電離質(zhì)譜(HR-ESI-MS)、核磁共振(NMR)測試鑒定了這2個成分的結(jié)構(gòu)。

注：A,1.黃諾苷對照品；B，2馬里苷對照品；C1、C2.雪菊總黃酮液相圖譜。圖2 雪菊總黃酮液相圖譜

采用所述液相分析條件(見圖2)，測定結(jié)果顯示：馬里苷在4.124～82.48 μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，按峰面積(Y)和對照品含量(X)進行計算，所得回歸方程為Y=1.837×106X-1736.9(r=0.999 9，n=6)；黃諾馬苷在0.401～ 8.016 μg呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，按峰面積(Y)和對照品含量(X)進行計算，所得回歸方程為Y=9.738×105X-201.99(r=0.999 9，n=5)。測得雪菊總黃酮(CTFE)中黃諾瑪苷和馬里苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為105.2、130.5 mg·g-1。

3.2 DPPH測試

各樣品對DPPH自由基的清除率見表1。根據(jù)清除率隨樣品溶液濃度變化的數(shù)據(jù)，計算出雪菊總黃酮、黃諾馬苷、馬里苷及蘆丁對該自由基的IC50分別為(11.06±0.37)、(26.23±0.60)、(6.84±0.42)、(7.72±0.98)μg ·mL-1。

3.3 ABTS測試驗

各樣品對ABTS自由基的清除率見表2。根據(jù)清除率隨樣品溶液濃度變化的數(shù)據(jù)，計算出雪菊總黃酮、馬里苷、黃諾馬苷及蘆丁對照品對該自由基的IC50分別為(139.3±1.7)、(117.5±0.7)、(92.6±2.0)、(368.6±1.2)μg ·mL-1。

表1 各樣品對DPPH自由基的清除率

表2 各樣品對ABTS自由基的清除率

4 討論

雪菊中主要成分為黃酮類，對雪菊提取物的抗氧化活性已有文獻報道[8-9]，但均限于提取物及其中總多酚含量的測定。本文首次對雪菊總黃酮的抗氧化活性進行測試，并進一步對其主要成分進行含量分析和相應(yīng)抗氧化活性研究。在DPPH體系中的清除能力排序：馬里苷>蘆丁>雪菊總黃酮>黃諾瑪苷；在ABTS體系中的清除能力排序：馬里苷>黃諾瑪苷>雪菊總黃酮>蘆丁。結(jié)果表明，雪菊總黃酮具有與對照品蘆丁相近的優(yōu)良抗氧化活性，其主要抗氧化活性成分為馬里苷、黃諾瑪苷等。

近年來有研究表明，雪菊具有較為明確的降血糖、降血壓、降脂等功能[7]，這在一定程度上與其抗氧化作用[4-8]有關(guān)。本文對雪菊總黃酮及其2個主要成分的體外抗氧化能力進行測試，可為雪菊今后在相關(guān)功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

[1] 新疆植物志編輯委員會.新疆植物志[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：93.

[2] 張燕，李琳琳，木合布力·阿布力孜等.新疆昆侖雪菊5種提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(7)：166-169.

[3] Dias T，Bronze M R，Houghton PJ，et al.The flavonoid rich fraction ofCoreopsistinctoriapromotes glucose tolerance regain and pancreatic function recovery in streptozotocin-induced glucose-intolerant rats [J].J Ethnopharmacol，2010，132(10)：483-490.

[4] Dias T，Liu B，Jones P，et al.Cytoprotective effect ofCoreopsistinctoriaextracts and flavonoids on tBH Pand cytokine-induced cell injury in pancreatic MIN6 cells [J].J Ethnopharmacol，2012，139(23)：485-492.

[5] 明婷，孫玉華，胡夢穎，等.金雞菊提取物降壓及體內(nèi)抗氧化作用的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(10)：249-252.

[6] 梁淑紅，哈木拉提，龐市賓，等.金雞菊提取物降血壓化學(xué)成分實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，21(7)：1619-1621.

[7] 梁淑紅，龐市賓，劉曉燕，等.金雞菊提取物降血脂作用的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，31(8)：495-498.

[8] 曹燕，龐市賓，徐磊，等.金雞菊提取物體外抗氧化活性[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(12)：144-147.

[9] Z?laru C，Crian C C，C?linescu I，et al.Polyphenols inCoreopsistinctoriaNutt.fruits and the plant extracts antioxidant capacity evaluation [J].Central Eur J Chem，2014，12(8)：858-867.

[10] Zhang Y，Shi S P，Zhao M B，et al.A novel chalcone fromCoreopsistinctoriaNutt.[J].Biochem Syst Ecol，2006，34(10)：766-769.

[11] 趙軍，孫玉華，徐芳，等.昆侖雪菊黃酮類成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(3)：50-52.

[12] 張?zhí)m蘭，孫玉華，哈木拉提，等.HPLC測定金雞菊中金雞菊查爾酮含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19(7)：48-49.

[13] 李帥，匡海學(xué)，岡田嘉仁，等.鬼針草有效成分的研究(Ⅱ)[J].中草藥，2004，35(9)：972-975.

[14] Sun Y，Yuan H，Hao L，et al.Enrichment and antioxidant properties of flavoneC-glycosides from trollflowers using macroporous resin [J].Food Chem，2013，141(1)：533-541.

InvestigationofAntioxidantCapacitiesofTotalFlavonoidExtractofCoreopsistinctoria

QIUJiajun1，GAOFei1，LIYaLi2*，LIUJiangyun1，MUHUYATIWulasihan3，HAOLili1，YANGShilin1

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Jiangsu，Suzhou，215123，China；2.VIPInternalMedicineDepartment，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；3.GeneralCardiologyDepartment，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China

Objective：Antioxidant capacities of the total flavonoid extract ofcoreopsistinctoria(CTFE) and its main constituents were investigated in this study.Methods：Key components in CTFE were separated and determined.DPPH and ABTS tests were applied to measure their antioxidant capacities.Results:Marein and flavanomarein were identified as two key components in CTFE.The half inhibition concentrations of CTFE against DPPH and ABTS free radical were 11.06 and 139.3 ·mL-1，respectively，similar to those of marein and flavanomarein.Conclusion:CTFE showed strong antioxidant capacities，with marein，flavanomare and other flavonoids as the bioactive constituents.

Coreopsistinctoria；antioxidant；marein；flavanomarein

2014-08-07)

國家自然基金項目(81460634)；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院自然基金項目(2013ZRZD07)

*

李雅麗，副教授，研究方向：非酒精性脂肪肝及代謝綜合征的基礎(chǔ)和臨床；Tel：(0991)4363245，E-mail：lylemai@sina.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.006