楊梅總黃酮對H2O2誘導血管內皮細胞損傷的保護作用△

林文彬，孫桂波，潘瑞樂，沈勝楠，王婷婷

(1.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研所，北京 100193)

·基礎研究·

楊梅總黃酮對H2O2誘導血管內皮細胞損傷的保護作用△

林文彬1，孫桂波2*，潘瑞樂2，沈勝楠2，王婷婷1

(1.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研所，北京 100193)

目的：探討楊梅總黃酮對過氧化氫(H2O2)誘導血管內皮細胞損傷的保護作用及其機制。方法：體外培養人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304，通過H2O2誘導建立血管內皮細胞損傷模型，利用噻唑藍(MTT)染色法研究楊梅總黃酮對血管內皮細胞存活率的影響，以MDA、LDH、SOD、NO含量的測定研究楊梅總黃酮對血管內皮細胞氧化應激的影響。結果：與模型組比較，楊梅總黃酮各給藥組細胞存活率及SOD、NO活性顯著提高，MDA含量和LDH漏出量顯著降低。結論：楊梅總黃酮可能通過抑制氧化應激，達到保護內皮細胞的作用。

楊梅總黃酮；過氧化氫；血管內皮細胞；氧化應激；指紋圖譜

血管內皮細胞凋亡是許多常見心血管疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓、高血脂等的病理機制之一[1]。內皮細胞凋亡與氧化應激等作用密切相關[2]，因此通過抑制氧化應激作用保護內皮細胞，對心血管疾病的防治有積極意義。楊梅為楊梅科楊梅屬植物，主要分布于長江流域以南。楊梅總黃酮廣泛存在于殼斗科、報春花科、菊科、豆科、蓼科等多種天然植物中[3-4]。文獻報道楊梅總黃酮具有較強的抗氧化作用[5]，用于治療缺血性腦血管疾病[6]，但其對血管內皮細胞是否有保護作用尚不清楚。本研究通過體外培養人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304，以過氧化氫(H2O2)誘導損傷建立內皮細胞氧化損傷模型，研究楊梅總黃酮對血管內皮細胞的保護作用，并探討可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜(G2I calss 2996型，美國waters)；倒置相差顯微鏡(CKX41型，日本Olympus)；超凈工作臺(ZHJH-C1115B型，上海智成分析儀器制造有限公司)；微孔板掃描酶標儀(MQX200型，美國BioTek instrument)；臺式離心機(TDL-5013型，上海安亭科學化學儀器廠)；二氧化碳細胞培養箱(Heraeus BB15型，美國Thermo Scientific)。

1.2 材料

甲酸、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；H2O2(國藥集團化學試劑有限公司)；DMEM培養基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程研究所)；考馬斯亮藍、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化碳(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；楊梅總黃酮(Myricetin)由中國醫學科學院藥用植物研究所化學室潘瑞樂老師從楊梅樹皮中提取，楊梅樹皮用60%乙醇提取濃縮得到浸膏。根據前期實驗，D101大孔樹脂具有良好的吸附性，以70%乙醇為洗脫劑洗脫，濃縮干燥得到總黃酮，得率達75.3%，縮寫為Myr；槲皮素(Quercetin，中國食品藥品檢定研究院，縮寫為Que)；人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV-304，中國醫學科學院上海細胞生物學研究所)。

2 方法

2.1 楊梅樹皮總黃酮UPLC-PDA指紋圖譜

采用Acquity BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A：0.1%甲酸-水，B：乙腈，洗脫條件：0～28 min為5%-100%乙腈，28～30 min為100%乙腈；流速為0.4 mL·min-1；進樣量為2 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm，測定楊梅樹皮總黃酮指紋圖譜。

2.2 人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304的培養

凍存的ECV-304細胞經過復蘇后，加入10%滅活的胎牛血清完全培養基，放入37 ℃、5%CO2的培養箱。當細胞融合形成單層時，吸去培養基，PBS液洗滌細胞3次，加入0.125%的胰酶，消化2 min，在顯微鏡下觀察，發現細胞形態皺縮，間隙增大時，加入完全培養基終止消化，反復吹打細胞，形成細胞懸液，并按1∶2的比例傳代。

2.3 H2O2誘導人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304損傷模型的建立

以每孔1×104個細胞的密度接種ECV-304細胞于96孔培養板上，放入37 ℃、5%CO2培養箱培養，細胞達到80%匯合時進行實驗。用無血清培養基配成濃度分別為125、250、500、1000 μmol·L-1的H2O2劑量組，作用細胞6、12、18、24 h后，通過MTT法測細胞吸光度值(A)。

細胞存活率(%)=各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)×100%

2.4 楊梅總黃酮對正常人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304的影響

以每孔1×104個細胞的密度接種ECV-304細胞于96孔板上，當細胞達到80%匯合時進行實驗。實驗分為空白對照組(無血清培養基)與楊梅總黃酮給藥組(濃度分別為12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)，每組6復孔，每孔加入100 μL培養基，各組分別預孵育24 h，采用MTT法測定細胞存活率，并重復3次。

2.5 楊梅總黃酮對H2O2誘導損傷血管內皮細胞的保護作用

以每孔1×104個細胞的密度接種ECV-304細胞于96孔板上，細胞達到80%匯合時進行實驗。實驗分為空白對照組(無血清培養基)、楊梅總黃酮給藥組(濃度分別為12.5、25、50 μmol·L-1)和槲皮素組(濃度為100 μmol·L-1)，各給藥組分別預孵育1、2、3、4 h后，離心，棄上清后PBS洗兩次，500 μmol·L-1H2O2作用18 h后，利用MTT法測定細胞存活率，并且確定楊梅總黃酮保護H2O2誘導損傷的血管內皮細胞的最佳孵育時間。

2.6 楊梅總黃酮對H2O2誘導損傷血管內皮細胞中MDA、LDH、SOD和NO含量的影響

以每孔2×105個細胞的密度接種ECV-304細胞于6孔板，待細胞長至80%匯合以后進行實驗。實驗分組同2.5。空白組每孔加入2 mL無血清培養基，各給藥組每孔加入2 mL含藥培養基，預敷藥3 h，離心，棄上清后PBS洗兩次，500 μmol·L-1H2O2作用24 h。按試劑盒說明書方法測定上清液中的LDH含量，反復凍融裂解細胞，2500 r·min-1離心10 min，測定上清液中蛋白濃度及MDA、SOD、NO的含量。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 楊梅樹皮總黃酮UPLC-PDA指紋圖譜

通過光電二極管陣列檢測器(PDA)檢測器對楊梅樹皮總黃酮全波長掃描(200～400 nm)，比較各波長下色譜圖。在254 nm處，色譜峰信號較強，分離度好，基線平緩，因此選定254 nm為指紋圖譜的測定波長。5個特征峰分別是楊梅苷、槲皮苷、槲皮素、楊梅醇、楊梅酮，其中楊梅苷相對含量最多。研究數據見圖1、表1。

注：1.楊梅苷；2.槲皮苷；3.槲皮素；4.楊梅醇；5.楊梅酮。圖1 楊梅樹皮總黃酮的UPLC-PDA指紋圖譜

表1 楊梅樹皮總黃酮的UPLC-PDA指紋圖譜色譜峰分析

3.2 H2O2誘導ECV-304細胞氧化損傷模型的建立

研究數據顯示：隨著H2O2濃度的升高和作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低。當500 μmol·L-1H2O2作用18 h時細胞存活率達49.76%，因此其可作為造模的最佳條件。見圖2。

圖2 H2O2誘導血管內皮細胞ECV-304氧化損傷模型的建立

3.3 楊梅總黃酮對正常血管內皮細胞的影響

研究數據顯示：楊梅總黃酮各劑量組(濃度分別為12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)預孵育24 h后，細胞存活率分別為(98.51±2.10)%、(98.70±1.44)%、(98.15±2.29)%、(91.26±1.90)%和(83.44±1.24)%，正常對照組細胞存活率為(100±3.5)%。各給藥組細胞存活率在12.5～50 μmol·L-1與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，表明楊梅總黃酮給藥濃度在12.5～50 μmol·L-1對正常的血管內皮細胞ECV-304沒有毒性損傷；楊梅總黃酮在給藥濃度75～100 μmol·L-1，細胞存活率與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，表明楊梅總黃酮在給藥濃度75～100 μmol·L-1對細胞可能有一定的毒性作用。見圖3。

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖3 楊梅總黃酮對正常血管內皮細胞的影響

3.4 楊梅總黃酮預處理對H2O2誘導損傷血管內皮細胞的保護作用

槲皮素(濃度為100 μmol·L-1)和楊梅總黃酮(濃度分別為12.5、25、50 μmol·L-1)預孵育1、2、3、4 h后，加500 μmol·L-1H2O2作用18 h。研究結果顯示，濃度為100 μmol·L-1的槲皮素預孵育ECV-304細胞的不同時間點，均能提高H2O2誘導損傷后血管內皮細胞的成活率；隨著楊梅總黃酮孵育ECV-304細胞時間的延長，劑量依懶性地提高誘導損傷后細胞的成活率，表明楊梅總黃酮預處理對H2O2誘導損傷的血管內皮細胞具有保護作用。孵育3、4 h后成活率差異無統計學意義(P>0.05)，因此3 h作為預孵育時間，用于后續操作。見圖4。

注：與孵育3 h相比，*P<0.05，**P<0.01。圖4 楊梅總黃酮預處理對H2O2誘導損傷血管內皮細胞的保護作用

3.5 楊梅總黃酮對H2O2誘導損傷后血管內皮細胞酶活力的影響

研究結果顯示，與空白對照組相比，H2O2誘導損傷的模型組中MDA、LDH含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性和NO含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，楊梅總黃酮各給藥組劑量依懶性地降低MDA、LDH的含量，提高SOD活性和NO含量，并且差異有統計學意義(P<0.05)。表明楊梅總黃酮可以通過增強抗氧化酶的活力，抑制H2O2對ECV-304細胞的氧化損傷。見圖5。

注：與空白對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖5 梅總黃酮對H2O2誘導損傷血管內皮細胞酶活力的影響

4 討論

血管內皮細胞可以維持血管結構，具有抗凝血、抗炎癥、防止炎性細胞粘附血管壁的作用[7]。炎癥反應、缺血再灌注損傷等會造成氧自由基的增多，具有活性的氧自由基可能導致血管內皮細胞功能障礙，膜通透性增加，白細胞浸潤，干擾細胞信號傳導，最終引起內皮細胞凋亡[8]。因此，通過抑制氧化應激，保護血管內皮細胞具有重要意義。本實驗通過體外培養ECV-304細胞建立H2O2誘導損傷的模型，觀察楊梅總黃酮對細胞存活率及生化指標的影響，探討其對氧化損傷的血管內皮細胞的保護作用。研究發現，500 μmol·L-1H2O2作用18 h誘導損傷的血管內皮細胞，經MTT測定細胞存活率為49.76%，證明H2O2誘導的血管內皮細胞損傷模型成功。254 nm波長下指紋圖譜的測定表明，楊梅樹皮總黃酮主要含有楊梅苷、槲皮苷、槲皮素、楊梅醇、楊梅酮。我們通過UPLC指紋圖譜控制樣品質量相對穩定、均一，并應用于楊梅總黃酮預給藥實驗。研究證明，楊梅總黃酮預給藥能夠抑制H2O2誘導的血管內皮細胞損傷，且50 μmol·L-1楊梅總黃酮預給藥3 h保護作用最佳。

楊梅總黃酮對氧化損傷血管內皮細胞的保護作用通過酶活力測定被進一步證實。H2O2在體內通過氧化分解形成氧自由基，細胞內清除氧自由基的SOD被大量消耗。氧化應激導致細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，產生大量的脂質過氧化產物MDA，細胞膜對鈉、鈣和其他大分子物質通透性增大，LDH漏出增加，細胞發生毒性水腫，脂質過氧化反應對內皮細胞造成進一步損害[9]。研究發現，H2O2誘導損傷的細胞中MDA、LDH含量顯著升高，SOD含量顯著降低，而楊梅總黃酮和槲皮素組MDA、LDH含量顯著低于模型組，SOD含量顯著高于模型組，并且存在劑量依賴性。證明楊梅總黃酮具有抑制氧化損傷的能力，這可能與其直接清除已形成的活性氧或抑制活性氧的形成有關。

NO是血管內皮細胞分泌的一種內源性舒張因子，與松弛血管平滑肌、擴張血管等作用密切關聯[10]。氧自由基生成增多，內皮功能障礙，加速NO的氧化降解。NO合成減少或體內利用率降低可引起血管內皮依賴性舒張功能減低[11]。研究發現，與正常對照組比較，H2O2誘導的氧化損傷可使細胞中NO顯著降低；與模型組相比，楊梅總黃酮各給藥組和槲皮素組的NO含量顯著升高，并且呈劑量依懶性。提示楊梅總黃酮可能通過抑制氧自由基對NO的分解，保護血管內皮細胞ECV-304。

文獻報道，具有抗氧化活性的植物能夠抑制血管內皮細胞的損傷[12-13]。楊梅總黃酮作為天然的抗氧化劑具有巨大的開發和應用潛力，尤其在防治心血管疾病方面效果顯著[14]。本研究證實，楊梅總黃酮預給藥對H2O2誘導損傷的血管內皮細胞具有一定的保護作用，可能與其抑制自由基及脂質過氧化產物的產生，增強細胞抗氧化能力的機制有關。本研究結果為楊梅總黃酮在預防心血管疾病方面的藥物研發及臨床應用提供了參考。

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ProtectiveEffectsofMyricetinAgainstInjuryInducedbyH2O2inVascularEndothelialCells

LINWenbin1，SUNGuibo2*，PANRuile2，SHENShengnan2，WANGTingting1

(1.CenterofResearchandDevelopmentonLifeSciencesandEnvironmentalSciences，HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China；2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：The study observed the protective effects of myricetin against injury induced by H2O2in vascular endothelial cells and further explored the possible mechanism.Methods：Our study cultured vascular endothelial cells ECV-304 in vitro and established the injury of myricetin induced by H2O2。To evaluate the protective effect of ECV-304 on the cell viability，our study detected the MTT production.Our study discussed the effect of myricetin on oxidative stress through determining the contents of LDH，MDA and the activities of SOD，NO by the kits，respectively.Results：The results shows that myricetin could increase the cell viability and the activities of SOD，NO.The contents of MDA and LDH were attenuated by myricetin.Conclusion：Myricetin could protect the vascular endothelial cells through restraining the oxidative stress action.

Myricetin；H2O2；Vascular endothelial cells；Oxidative stress；Chromatographic fingerprint analysis

2014-12-12)

國家重大新藥創制專項(2012ZX09103201-004)

*

孫桂波，博士，研究員，研究方向：心血管藥理；E-mail：gbsun@ implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.008