蘇鐵葉黃酮類化合物的檢測與提取工藝研究△

史紅艷，朱海萍，楊培君

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

·基礎研究·

蘇鐵葉黃酮類化合物的檢測與提取工藝研究△

史紅艷，朱海萍，楊培君*

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

目的：以蘇鐵葉為研究材料，開展黃酮類化合物的檢測，同時對其提取工藝進行優(yōu)化。方法：以UV法檢測的蘇鐵葉總黃酮得率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗，優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果：定性檢測顯示，蘇鐵葉中含黃酮、二氫黃酮等黃酮類化合物組分。研究結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)：提取溫度為80 ℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶25，提取時間為1.5 h。在此條件下總黃酮的平均得率為1.67%。結(jié)論：該工藝合理，重復性好，能有效提高蘇鐵葉總黃酮得率。

蘇鐵葉；總黃酮；檢測；工藝優(yōu)化

蘇鐵葉為蘇鐵科蘇鐵屬植物蘇鐵CycasrevolutaThunb.的葉，又名鐵樹葉[1]、鳳尾蕉葉[2]。甘、淡，平，小毒。入肝、胃經(jīng)，有理氣、活血功能[2]。相關(guān)研究報道[4-6]，蘇鐵葉中藥復方制劑經(jīng)煎煮后對小鼠腫瘤生長有抑制作用[3]，可治療胃癌、肺癌、肝癌等。據(jù)調(diào)查，陜南民間有鐵樹葉治結(jié)腸炎等疾病的用法。

相關(guān)研究報道[7-11]，黃酮類化合物具有多種生理活性，如抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒、抗糖尿病、抗抑郁、延緩衰老、增強心血管功能、保護神經(jīng)系統(tǒng)、改善記憶力以及增強免疫力等。對蘇鐵研究報道較少，潘韜文報道了蘇鐵種皮[12]；劉世彪報道了蘇鐵種子的化學成分及毒性[13]；熊江等[14]從貴州蘇鐵葉中分離出8種化合物；楊秋利[15]對蘇鐵中的微量元素進行了測定；此外，有關(guān)蘇鐵分類學[16]、解剖學[17]、分子生物學[18-19]方面以及提取物病理學研究[4，20]也有報道，但蘇鐵葉中黃酮類化合物的系統(tǒng)研究尚未見報道。本研究以蘇鐵葉為供試材料，通過乙醇水溶液熱回流提取法，開展蘇鐵葉總黃酮化合物的檢測及提取工藝條件的優(yōu)化，以期為蘇鐵葉黃酮類化合物的研究與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇鐵葉于2012年9月采集于陜西漢中市栽培植株，烘干后粉碎，過粒徑為0.45 mm的篩，備用。

1.2 試劑與儀器

亞銷酸鈉(NaNO2)、氯化鋁(AlCl3)、氫氧化鈉(NaOH)、95%乙醇、無水乙醇、乙醚等均為分析純；蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)。

紫外可見分光光度計(UV-2550，日本島津)；電子天平(梅特勒AL204，精密度0.000 1 g)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國IKA公司)；優(yōu)普超純水機(UPH-Ⅱ，成都超純科技有限公司)；索氏提取儀。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的提取 考慮溶劑的極性、毒性及后續(xù)處理的難度，故選取一定濃度的乙醇作為提取溶劑，提取流程為蘇鐵葉粉末→乙醚去脂→乙醇熱回流→抽濾→定容→黃酮類化合物溶液。

1.3.2 總黃酮的定性測定 分別用鹽酸-鎂粉、鹽酸-鋅粉、硼氫化鈉(NaBH4)、AlCl3等8種顯色劑做顯色反應，對蘇鐵葉黃酮類化合物進行定性檢測。

1.3.3 UV法檢測設計與總黃酮的定量測定 取一定量的蘆丁標準品和樣品溶液，經(jīng)NaNO2-AlCl3顯色后，用UV-2550紫外可見分光光度計于400～600 nm波長掃描，以確定掃描波長。

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品6.0 mg，用60%乙醇水溶液溶解并定容于50 mL容量瓶，搖勻，即得蘆丁標準溶液。精密吸取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入濃度為0.5 mol·L-1的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入濃度為0.3 mol·L-1的AlCl3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入濃度為1.0 mol·L-1NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇稀釋至10.0 mL，配成系列標準溶液，放置15 min后，在確定的波長處測定吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度作標準曲線。

吸取2.0 mL樣品提取液于10 mL容量瓶中，按上述蘆丁標準曲線繪制方法配制溶液，以試劑空白為參比液，測其吸光度記為A，代入標準曲線得提取液濃度C(μg·mL-1)。按以下公式計算蘇鐵葉中總黃酮得率X(%)：

C為樣品溶液中黃酮類化合物的濃度(μg·mL-1)；V為供試樣品的體積(mL)；w為稱取樣品重量(μg)；b為供試液稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗 準確稱取脫脂后的蘇鐵葉粉末3份，每份1.0 g，置于三角瓶中，根據(jù)各提取因素，采用不同的單因素3水平試驗進行熱回流提取。抽濾后得乙醇提取液，濾渣重復提取2次，趁熱抽濾，合并濾液，并定容至100 mL。按標準曲線建立的方法測定吸光度，并計算總黃酮類化合物的得率。

1.3.5 正交試驗設計 考慮各因素之間的相互影響，試驗以蘇鐵葉中總黃酮得率為衡量指標。分別選取提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時間4因素及其對應的3個較優(yōu)水平，進行L9(34)正交試驗，確定提取總黃酮的最佳工藝條件，正交試驗設計見表1。

表1 因素水平表

1.3.6 方法驗證 重復性試驗：準確稱取蘇鐵葉粉末6份各1.0 g，按確定的工藝制備樣品溶液。以標準曲線的建立方法測定吸光度，計算蘇鐵葉黃酮類化合物含量。

回收率試驗：準確吸取3份已知質(zhì)量濃度的供試樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.5、1.5、2.5 mL的蘆丁標準液(質(zhì)量濃度為0.11 mg·mL-1)，按標準曲線的建立方法測定3組加標樣品的吸光度值，每組加標樣品平行測定3次，計算平均值。回收率公式：回收率(%)=(加標試樣測定黃酮量-已知試樣黃酮量)/加標量×100%

穩(wěn)定性試驗：移取樣品溶液2.0 mL，以標準曲線建立方法測定吸光度，每隔10 min測一次，測程70 min。

精密度試驗：移取最佳條件下提取的蘇鐵葉樣品液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按標準曲線的建立方法測定吸光度值，平行測定6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色反應結(jié)果

黃酮類化合物的定性檢測結(jié)果表明，蘇鐵葉中黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查爾酮等呈陽性反應，見表2。

表2 黃酮類化合物顯色反應結(jié)果

2.2 波長掃描結(jié)果

經(jīng)波長掃描，蘆丁標準溶液和黃酮樣品溶液在505 nm處均有吸收峰，且峰形相似，故蘆丁可作為對照品用于檢測蘇鐵葉黃酮類化合物。

2.3 標準曲線的繪制

配制系列濃度的蘆丁標準溶液，在波長505 nm處測定吸光度，并以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。蘆丁對照品溶液，在0～60 μg·mL-1與吸光度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=11.543X+0.0677，r=0.999 6，見圖1。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

2.4 提取次數(shù)的選擇

準確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，在溫度為80 ℃，乙醇濃度為60%，料液比為1∶20，提取時間2 h條件下，分別提取黃酮1、 2、3、4次。提取3次時總黃酮的得率相對最大，故選3次為最佳提取次數(shù)，見圖2。

圖2 提取次數(shù)對黃酮類化合物得率的影響

2.5 單因素試驗結(jié)果

2.5.1 提取時間對蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，固定其他3因素，比較提取時間對總黃酮得率的影響，重復提取3次，合并濾液。提取時間在2 h內(nèi)，總黃酮得率隨時間增加而增加；2～2.5 h其得率基本不變，之后得率反而下降。綜合考慮，選取2 h為最佳提取時間，見圖3。

圖3 提取時間對黃酮類化合物得率的影響

2.5.2 料液比對蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，固定其他條件，分別提取2 h，比較不同料液比對總黃酮得率的影響。隨料液比降低，蘇鐵葉總黃酮得率逐漸增加；但當料液比為1∶20時，總黃酮得率達到最大值；繼續(xù)降低料液比，其得率反而下降。故選取1∶20為最佳料液比，見圖4。

圖4 料液比對黃酮類化合物得率的影響

2.5.3 提取溫度對蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，在前2個最優(yōu)單因素條件下，固定其他條件，比較不同溫度對總黃酮得率的影響。隨提取溫度的升高，黃酮類化合物的得率增加；當達80 ℃以上，得率增加不明顯；繼續(xù)升高溫度得率降低。故選取80 ℃為最佳提取溫度，見圖5。

圖5 溫度對黃酮類化合物得率的影響

2.5.4 乙醇濃度對蘇鐵葉中總黃酮得率的影響 準確稱取1.0 g蘇鐵葉干粉，選擇以上3個最優(yōu)單因素，比較不同濃度乙醇對總黃酮得率的影響。當乙醇濃度達70%時，總黃酮得率獲最大值；再增大乙醇濃度，總黃酮得率反而降低。故選70%為最佳乙醇濃度，見圖6。

圖6 乙醇濃度對黃酮類化合物得率的影響

2.6 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎上，選擇L9(34)正交表，對提取溫度、乙醇濃度、提取時間和料液比4因素進行正交試驗，確定最佳提取條件，試驗結(jié)果見表3、方差分析見表4。

4因素中提取溫度對總黃酮得率影響最大，各因子對總黃酮得率的影響主次順序依次為提取溫度(A)>提取時間(C)>料液比(D)>乙醇濃度(B)。分析正交試驗結(jié)果，確定工藝條件為A3B2C1D3。結(jié)合單因素試驗結(jié)果，綜合考慮成本和以上因素，最終確定蘇鐵葉總黃酮的最佳工藝優(yōu)化條件為A2B2C1D3。即：提取溫度為80 ℃，乙醇濃度為70%，提取時間為1.5 h，料液比為1∶25。

表3 正交試驗結(jié)果

注：A1.提取溫度為70 ℃；A2.提取溫度為80 ℃；A3.提取溫度為90 ℃；B1.乙醇濃度為60%；B2.乙醇濃度為70%；B3.乙醇濃度為80%；C1.提取時間為1.5 h；C2.提取時間為2.0 h；C3.提取時間為2.5 h；D1.料液比為1∶15；D2.料液比為1∶20；D3.料液比為1∶25。

表4 方差分析結(jié)果

2.7 樣品的UV法檢測結(jié)果

在優(yōu)化的條件下，樣品的總黃酮平均得率為1.67%，RSD=2.66%，見表5。

表5 樣品的UV法試驗結(jié)果(n=3)

2.8 方法驗證試驗結(jié)果

重復性試驗結(jié)果，RSD=2.30%(n=6)，表明其重復性良好。回收率試驗結(jié)果表明，方法的準確度高，見表6。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，蘇鐵葉黃酮類化合物顯色后，30 min內(nèi)吸光度無明顯變化；30 min以后，吸光度逐漸降低；建議在30 min內(nèi)完成試驗測定。

精密度試驗結(jié)果：樣品溶液6次測定的平均吸光度值為0.457，RSD值為0.309%，表明儀器的精密度良好。

表6 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

3 討論

通過顯色反應定性確定蘇鐵葉中含有黃酮、二氫黃酮等黃酮類化合物，但其組分鑒定還有待進一步研究。在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗對蘇鐵葉黃酮類化合物的提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，隨各單因素的依次優(yōu)化，最優(yōu)條件逐步增多，黃酮的得率也隨之逐漸增大。優(yōu)化的蘇鐵葉總黃酮提取工藝條件：溫度為80 ℃，料液比為1∶25，提取時間為1.5 h，乙醇濃度為70%，此條件下蘇鐵葉的總黃酮得率為1.67%。各因素對蘇鐵葉總黃酮得率的影響主次順序依次為提取溫度(A)>提取時間(C)>料液比(D)>乙醇濃度(B)。在優(yōu)化工藝條件下，蘇鐵葉總黃酮得率較高，重復性好。采用本方法對蘇鐵葉提取液中總黃酮含量進行定量分析，其工藝及條件可行性和可操作性強，結(jié)果可靠。

不同植物材料總黃酮提取工藝有一定的差異，張吉祥等[21]采用微波輔助法提取棗核中的總黃酮，報道各因素對棗核黃酮提取的影響程度大小依次為料液比>提取溫度>提取時間>乙醇體積分數(shù)>微波功率；趙雪梅等[22]采用二次旋轉(zhuǎn)組合設計的方法，探討常山胡柚皮中黃酮類化合物的最佳提取工藝參數(shù)，指出影響黃酮提取率的參數(shù)主次順序為提取時間>料液比>提取溫度=乙醇濃度。比較結(jié)果表明，采用不同方法，在不同條件下提取黃酮類化合物，顯著性影響因素不同，而其他因素影響差別較小。因此，本試驗所得的優(yōu)化工藝條件合理，可為蘇鐵葉總黃酮的進一步研究和資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

張婧萱等[23]報道，淮山藥中總黃酮含量為1.12%；黃紅英等[24]測定青蒿中黃酮類化合物的含量為2.885%；曠春桃等[25]研究大葉冬青葉中總黃酮提取工藝，并采用氯化鋁法測定黃酮的含量，其總黃酮得率為0.68%；薛淑萍等[26]在優(yōu)化工藝條件下，測定桑葉中黃酮類化合物含量為0.18%。比較結(jié)果表明，蘇鐵葉中黃酮類化合物含量除低于青蒿外，高于淮山藥、大葉冬青葉、桑葉中的含量。因此，蘇鐵葉作為一種含黃酮類化合物的中草藥資源植物，具一定的開發(fā)利用潛力。

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Extraction and Determination of Flavonoids from Leaves ofCycasrevoluta

SHI Hongyan，ZHU Haiping，YANG Peijun*

(School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong Shaanxi 723001，China)

Objective：To study the extraction and determination of flavonoids from leaves ofCycasrevoluta.Methods：The total flavonoids was determined by UV.The yield of total flavonoids was used as index，the extraction condition was optimized by single factor test and orthogonal design L9(34).Results：The results showed that the leaves ofC.revolutacontained varied flavonoids，including flavones，dihydrogen flavones etc.The optimal extraction conditions were as the following：temperature of 80 ℃，ethanol concentration of 70%，solid-liquid ratio of 1∶25 and time 1.5 h.With this method，the extraction ratio of total flavonoids was 1.67%.Conclusion：The established method is reasonable，reproducible，and can effectively improve the yield of total flavonoids fromC.revolutaleaves.

Cycasrevolutaleaves；flavonoids；determination；technological optimization

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.009

2014-06-11)

國家中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(201207002)；漢中市科技計劃發(fā)展項目(2012-46-1)

*

楊培君，教授，研究方向：資源植物研究；E-mail：yang@snut.edu.cn