中藥材DNA條形碼鑒定研究進展△

辛天怡，雷美艷，宋經元,*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435)

·綜述·

中藥材DNA條形碼鑒定研究進展△

辛天怡1，雷美艷2，宋經元1,2*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435)

DNA條形碼技術給中藥鑒定學發展帶來新的機遇，中藥材DNA條形碼鑒定數據庫及中草藥DNA條形碼生物鑒定體系的創建有利于推進中藥鑒定標準化和國際化。中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則已納入《中華人民共和國藥典》2010版第三增補本，為中藥材基原物種鑒定提供強有力的科技支撐，將在中藥材及中成藥流通監管、道地藥材鑒別、保健食品和食品質量安全控制等領域發揮重要作用。將中藥材DNA條形碼分子鑒定法與中國藥典規定的其他鑒別方法相結合，能夠對藥品質量進行綜合評價與有效監控。

中藥材；DNA條形碼；鑒定；ITS2；psbA-trnH；COI

自2003年Paul Hebert首次提出“DNA條形碼”概念[1]，至今已逾10年。DNA條形碼分子鑒定技術走過了從無到有再到飛速發展的歷程。Miller稱DNA條形碼技術推動了分類學的“文藝復興”[2]，能夠給日漸萎縮的傳統形態分類學帶來新的發展機遇。如今，DNA條形碼技術已廣泛應用于不同行業，針對不同研究對象和內容，均有相關研究項目和工作組對中藥鑒定學、系統分類學、發育進化、生態學、生物多樣性保護等各個領域展開研究[3]。研究者認為該技術能夠有效監控珍稀瀕危物種進出口貿易，在中藥材流通領域及食品藥品監督管理等方面發揮巨大作用[4]。由于傳統鑒定方法在中藥材物種鑒定上存在局限性，為保證中藥材臨床用藥的安全、有效性，有必要采用新技術新方法對其進行補充，中藥材DNA條形碼分子鑒定法[5-6]為中藥材基原物種的鑒定提供了強有力的科技支撐。本文對DNA條形碼技術在中藥材鑒定及相關領域的研究進展進行綜述，并對該技術的應用前景進行展望。

1 中藥材DNA條形碼分子鑒定研究進展

為解決中藥行業對中藥材基原物種鑒定的需求，Chen等[7]基于大量實驗樣本在國際上首先驗證并確立ITS2序列作為藥用植物通用條形碼，并在川芎、蛇床、麥冬等藥材基原物種及其混偽品的鑒定工作中得到良好應用[8-10]。基于DNA條形碼技術在藥用植物物種鑒定等的成功應用，研究者將該技術應用范圍逐步擴大到中藥材。2014年Biotechnology Advances文章[11]以“DNA條形碼鑒定是草藥鑒定從形態到DNA的文藝復興”介紹了該團隊創建的中藥材DNA條形碼鑒定體系和數據庫，該數據庫涵蓋中國、日本、韓國、印度、美國和歐洲藥典中記載的絕大部分藥材的DNA條形碼序列，對推進中藥鑒定方法通用化、標準化和國際化具有重要作用。

1.1 中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則的確立

陳士林等[6]基于大樣本量實驗創建以ITS2序列為主要條形碼的中藥材DNA條形碼分子鑒定體系，并提出中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列；動物類中藥材采用COI為主體序列，ITS2為輔助序列，符合中藥材鑒定簡單、精確的特點，有明確的判斷標準，能夠實現對中藥材及其基原物種的準確鑒定。目前該指導原則已納入《中華人民共和國藥典》(2010版 第三增補本)[12]，主要用于規范中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應用提供指導，適用于中藥材(包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片)及其基原物種的鑒定，其流程如圖1所示。

圖1 中藥材DNA條形碼分子鑒定流程

1.2 中藥材DNA條形碼分子鑒定法應用實例

2012年，辛天怡等[13]采用DNA條形碼分子鑒定技術對羌活藥材及其混偽品進行研究，證實ITS/ITS2序列能夠穩定、準確區分羌活藥材及其混偽品，該研究為后續工作提供了新的思路。Hou等[14]對山茱萸的研究表明，DNA條形碼分子鑒定法能夠用于新鮮或自然干燥樣本的鑒定，而市售山茱萸藥材多采用文火烘或置沸水中略燙以去除果核，再行干燥，如此處理方法使得市售山茱萸藥材DNA降解嚴重，無法獲得滿足后續實驗的基因組DNA，故DNA條形碼分子鑒定法不適用于市售山茱萸藥材的鑒定。該研究提示DNA條形碼分子鑒定法必須要在適宜范圍內應用，對于已經過炮制加工(簡單切制、低溫干燥等除外)的飲片，此方法具有局限性。研究者已對中國藥典收載中藥材進行實驗研究(表1列舉部分案例)，證實該方法的實用性價值，擴充和完善中藥材DNA條形碼數據庫，并將其逐漸應用于實際鑒定工作當中[15]。該方法能夠在中藥生產企業原料監管、醫院藥房中藥材飲片真偽鑒定、中藥材流通領域、出入境檢驗檢疫、海關中藥材進出口管理與鑒定等方面發揮重要作用。

表1 中藥材DNA條形碼分子鑒定研究實例

2 DNA條形碼分子鑒定技術在中藥及相關領域的應用前景

2.1 中成藥DNA條形碼分子鑒定

近年來中藥作為西藥的補充或替代在亞洲之外的應用與日俱增[72]。中藥制品的日益普及使得該行業產值每年增加數百萬美元[73]，與此同時全球補充和替代藥物的使用也在增加。中醫處方通常包含不同動植物來源藥材，協同作用、相互影響以達到預期治療效果。方劑中不同藥材加工炮制方法的特殊性，所含成分的生物來源難以確定，均會導致有關中藥質量、療效和安全性等方面的問題[74]。Newmaster等[75]對于北美12家公司44種草藥產品的檢測結果顯示大部分草藥產品均能夠獲得DNA條形碼序列(rbcL+ITS2序列)。59%的供試樣本中含有未在標簽上列出的物種；68.2%的供試樣本中存在替代品；實驗中涉及到的草藥產品多數質量較差，含有大量替代品、雜質或其他無藥用價值的填料；僅有2家公司的產品未檢出任何替代品。該研究表明DNA條形碼技術能夠用于北美草藥產品市場監控，有助于監督制藥企業為消費者提供安全、優質的草藥產品。

目前基于DNA條形碼技術對中成藥進行鑒定的相關報道較少，但已有研究者采用DNA分子鑒定技術對中成藥進行鑒定。Cheng等[76]基于高通量測序技術和宏基因組數據分析等方法，對中成藥六味地黃丸物種組成進行分析，結果顯示不同廠商生產的六味地黃丸物種組成上差異較大，影響其臨床療效。Coghlan等[77]基于高通量測序技術檢測包括散劑、片劑、膠囊劑、膽片和草藥茶等在內的15種不同劑型的中成藥，共獲得超過49 000條trnL和16S rRNA序列，證實第二代高通量測序技術(high-throughput sequencing，HTS)是在基因層面檢測復方中藥的有效方法。部分供試樣本中含有瀕危野生動植物物種國際貿易公約(CITES)中所收載的物種、潛在毒性/致敏性植物或未申明成分。序列比對結果顯示植物藥中含有68個不同科屬的植物，包括麻黃屬(Ephedra)、細辛屬(Asarum)等具有潛在毒性的屬種；動物藥中包含一些漸危、瀕危甚至極度瀕危的種屬，如亞洲黑熊(Ursusthibetanus)、賽加羚羊(Saigatatarica)。此外，許多供試品中檢測出含有一些極少在產品包裝上標識的牛科(Bovidae)、鹿科(Cervidae)和蟾蜍科(Bufonidae)動物的DNA。該研究表明采用高通量測序技術進行深度測序是檢測中成藥的有效手段，植物DNA相關數據庫的完善將有助于監測中成藥的合法性和安全性。崔占虎等[78]基于psbA-trnH和rbcL序列，通過克隆技術對連翹敗毒丸中原料藥材進行分子鑒別，結果顯示psbA-trnH序列能夠鑒定出連翹敗毒丸19種原料藥材中的9種，rbcL序列能夠鑒定出其中6種，二者一共能夠鑒定出10種藥材。由此可見，DNA條形碼技術在中成藥鑒定工作中運用尚不廣泛，需要加強此方面的研究。

2.2 保健食品DNA條形碼分子鑒定

DNA條形碼分子鑒定技術除了發揮其在藥用植物及中藥材物種鑒定領域的優勢之外，亦可嘗試將其應用于保健食品鑒定工作中。食品質量安全一直是消費者及食品安全監督管理機構關注的重點，無論何種情況，食品質量問題一旦被媒體報道出來，都會對輿論造成很大影響。為保證食品質量，各國政府均依據本國實際情況制定有關食品生產及保藏的國家標準[79]。保健食品作為特殊食品，其質量安全同樣極受關注。我國《保健食品注冊管理辦法(試行)》由國家食品藥品監督管理總局頒布[80]，于2005年7月1日正式實施，該辦法對保健食品進行嚴格定義如下：保健食品指聲稱具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質為目的的食品。即適宜于特定人群食用，具有調節機體功能，不以治療疾病為目的，并且對人體不產生任何急性、亞急性或者慢性危害的食品。依據國家食品藥品監督管理總局規定，列入既是食品又是藥品的物品名單的中藥材共84種[81]，可用于保健食品的共114種[82]，保健食品禁用物品共59種[83]。為保證保健食品質量安全可靠，確保其不含有禁用物品列表中的物種，有必要對其原材料物種來源進行監控。

目前食品監控多采用蛋白質或DNA序列分析方法，基于蛋白質的分析方法主要包括免疫組化分析、高效液相色譜(HPLC)和薄層色譜(TLC)等[84，85]。然而上述方法僅適用于新鮮食品，對于已經過深加工的食品，其效率較低；相較而言，基于DNA序列的鑒定方法更為適用，DNA序列提供的有效信息比蛋白質豐富，且易于提取，即使供試樣品量較少也能夠獲得滿足后續分析的基因組DNA，適用于不同類型食物，因此可選用基于DNA序列的方法對深加工食品進行鑒定[86-88]。隨著分子生物學技術迅速發展，DNA分子標記已逐漸用于追蹤食品生產工業流水線上的原材料[88-90]。研究者正在嘗試將DNA條形碼分子鑒定技術應用于保健食品原材料及深加工制品物種鑒定方面，實現其在保健食品原料質量控制方面的作用，以保證食品質量安全并有效防止商業欺詐現象。De Mattia等[91]采用CBOL提出的核心條形碼序列matK+rbcL及trnH-psbA間隔序列對唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(Mentha)、羅勒屬(Ocimum)、牛至屬(Origanum)、鼠尾草屬(Salvia)、百里香屬(Thymus)和迷迭香屬(Rosmarinus)植物進行鑒定。結果顯示除牛至屬墨角蘭(OriganummajoranaL)和牛至(OvulgareL)兩個物種由于雜交事件使得種內變異均高于其種間變異之外，大部分樣本都能夠鑒定到物種；matK和trnH-psbA序列能夠有效區分市售正品羅勒(OcimumbasilicumL)及其同屬植物。Xin等[29]對“藥食同源”的枸杞子進行鑒定分析，結果表明ITS2序列能夠區分寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)、枸杞(Lchinense)和黑果枸杞(Lruthenicum)三個物種，可以作為枸杞子及其近緣物種鑒定的DNA條形碼。

2.3 DNA條形碼分子鑒定的其他應用

中藥材生態型多樣性是道地藥材研究的重要組成部分，黃林芳等[92]對產自新疆及內蒙古兩大生態適宜生產集中區(兩類生態型)野生肉蓯蓉(CistanchedeserticolaYC Ma)的psbA-trnH序列分析結果表明，不同產地肉蓯蓉psbA-trnH序列存在變異位點，序列比對后新疆、內蒙古產肉蓯蓉在191 bp處存在G-A變異，該序列可以區分野生肉蓯蓉生態型。由于植物不同的栽培品種基因遺傳變異較小，且往往存在雜交繁育事件，采用通用DNA條形碼序列進行藥用植物栽培品種水平的鑒定存在局限性。Kane和Cronk提出基于整個葉綠體基因組和大部分核基因組的“超級條形碼(ultra-barcoding)”方法[93]，與傳統DNA條形碼技術僅需要相對較短的通用DNA序列相反，該方法將葉綠體全基因組與部分核基因組相結合，為證明物種水平以下的遺傳多樣性提供充足的信息，能夠區分純系和雜交品系，因此該方法比傳統DNA條形碼技術靈敏度更高。Li等[94]提出利用單分子測序技術的環狀一致測序策略的葉綠體基因組測序與SNP檢測流程，該方法具有迅捷的拼接效率和對SNP的高精度檢測能力，在基于葉綠體基因組序列的進化生物學和基因組學研究方面有著巨大的應用前景，也是推進藥用植物超級條形碼研究的有力工具。Kane等[95]采用超級條形碼對可可(TheobromacacaoL)進行鑒定，發現可可葉綠體基因和核基因中存在單核苷酸多態性(SNP)，有利于鑒別不同栽培品種。該研究為中藥“道地藥材”品種及鑒定提供了新思路。

除上述應用領域之外，亦有研究者將DNA條形碼技術應用于食用菌鑒定中。李艷春等[96]對于云南食用牛肝菌的研究表明，被云南當地人認為的4“種”牛肝菌經鑒定為12個獨立物種，該研究篩選出rpbl序列作為牛肝菌屬(Boletus)的核心條形碼，tefl-α和rpb2可作為輔助條形碼用于該屬真菌的鑒定。Avin等[97]基于ITS序列對側耳科(Pleurotaceae，平菇Pleurotusostreatus、杏鮑菇Peryngii)、膨瑚菌科(Physalacriaceae，金針菇Flammulinavelutipes)和小皮傘科(Marasmiaceae，香菇Lentinulaedodes)中的常見食用菌進行鑒定，證實ITS序列能夠作為擔子菌分類鑒定的核心DNA條形碼。在此基礎之上Avin等[98]基于IGS1和ITS序列相結合對栽培平菇(來源于側耳屬Pleurotus)的遺傳變異情況和物種界定進行分析。

3 展望及挑戰

隨著十余年的發展，DNA條形碼技術已逐漸走向成熟，該技術已由科研人員的理論及實驗研究層面逐步轉變為面向市場、面向企業、面向食品藥品監督管理部門等的實際應用方面的研究。該技術為緩解食藥監管、瀕危物種監管及海關進出口檢驗檢疫部門，醫藥企業，農業和畜牧業等不同行業缺乏傳統分類學人才的現狀奠定基礎。將DNA條形碼分子鑒定法應用于中藥材鑒定，無疑是對傳統藥材鑒定方法的一個巨大補充。構建中藥材DNA條形碼分子鑒定數據庫，有利于對中藥材的準確快速鑒定，可滿足不同行業人員對中藥材鑒定的需求，對保證臨床用藥安全提供堅實基礎。

物種鑒定能夠確保藥品的“真偽”，而有效成分或有效部位含量測定則可確保藥品的“優劣”，二者均是藥品質量控制工作中不可或缺的步驟。雖然DNA條形碼技術具有廣泛的應用前景，但在研究過程中亦會遇到各種挑戰，該技術并不能完全替代其他現有鑒別技術手段，如顯微、理化、色譜和光譜等對中藥材、飲片及中成藥進行物種鑒定和質量控制。不同入藥部位的中藥材根據其組織結構特征不同，藥材在采收時所含生活細胞的量均具有差異，某些特定部位，如根皮等其外部多具有木栓組織，其中的木栓細胞為死細胞，DNA降解程度較高，會對實驗產生一定影響，在操作時應當盡量去除此類組織。此外，儲存時間較久、貯藏養護方式不當造成中藥材、飲片和中成藥生蟲、變色、走油或霉變等現象，會嚴重影響其質量和療效，此類情況在進行DNA條形碼鑒定過程中，可能會由于DNA降解過于嚴重而無法成功獲得其條形碼序列，亦或由于霉變使得提取到的藥材DNA被真菌污染從而影響鑒定結果。因此，在實際藥檢工作中如若遇到上述情況，須將DNA條形碼技術與其他方法相結合進行檢驗，綜合評價藥品質量。

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DNA Barcoding of Traditional Chinese Medicine

XIN Tianyi1，LEI Meiyan2，SONG Jingyuan1,2*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Chongqing 408435，China)

DNA barcoding provides a new opportunity to the development of Authentication of Chinese Materia Medica.The establishment of the DNA barcoding system for herbal materials and the online DNA barcoding database are accelerating the standardization and internationalization of the authentication methods of Chinese Materia Medica.The guiding principles for molecular identification of traditional Chinese medicine using DNA barcoding technology have been documented in the enlarged edition III of Chinese Pharmacopoeia(2010 edition).These principles strongly support the identification of the traditional Chinese medicine.It will play an important role in the market circulation and supervision of traditional Chinese medicine and patent Chinese medicine，identification of genuine medicinal materials，and quality control of functional food and other food in the future.The combination of DNA barcoding and other identification techniques recorded in Chinese Pharmacopoeia can perform the comprehensive evaluation and effective supervision to the drug quality.

herbal materials；DNA barcoding；identification；ITS2；psbA-trnH；COI

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.020

2014-01-09)

國家自然科學基金資助項目(81373922)

*

宋經元，Tel：(010)57833199，E-mail：jysong@implad.ac.cn