陜重樓甾體皂苷類單體豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對

張宇晨，宋延平，王昌利，王偉

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥研究院，陜西 西安 710003)

·基礎研究·

陜重樓甾體皂苷類單體豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對

SMMC-7721細胞增殖的影響△

張宇晨1，宋延平2*，王昌利1，王偉1

(1.陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥研究院，陜西 西安 710003)

目的：探討陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響。方法：將不同濃度單體A(BM-26)與人肝癌SMMC-7721細胞分別在24、48、72 h處理后，采用MTT法，測定吸光度A值，并計算細胞增殖抑制率，檢測陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對腫瘤細胞增殖的影響。結果：不同質量濃度陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對人肝癌SMMC-7721細胞均有抑制作用：24 h處理時，質量濃度為8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h處理時，質量濃度為0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h處理時，質量濃度為8、40 μg·mL-1組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中質量濃度為8 μg·mL-1時，在24、48、72 h抑制率分別為45%、41%、36%。結論：陜重樓單體A(BM-26)對人肝癌SMMC-7721細胞增殖具有一定的抑制作用，且最強抑制質量濃度為8 μg·mL-1，有效抑制質量濃度范圍是8～40 μg·mL-1。

陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)；人肝癌SMMC-7721細胞；細胞凋亡

重樓藥用價值很高，具有清熱解毒、消腫散瘀、止血止痛之功能[1]。常作為主藥入方或單味用于腫瘤及其他病的治療。陜產重樓，別名七葉一枝花、燈臺七、蚤休，為百合科植物七葉一枝花ParispolyphyllaSmith Var.chinensis(Franch)Hara的干燥根莖，主產于秦嶺、太白山等地區。能清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚。用于治療疔瘡癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐。[2]前期研究已證明陜西重樓乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位對離體H180和H22腫瘤細胞株有一定的抑制作用，本文中陜重樓正丁醇提取物單體化合物A(BM-26)為豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside)，外觀為無定型白色粉末，易溶于吡啶，可溶于甲醇，ESI-MS m/z：575 [M+H]+，分子式為C35H58O6。Liebermann-Burchard反應和Molish反應均呈陽性，說明陜重樓正丁醇提取物單體化合物A(BM-26)為甾體類成分。本文觀察了陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對人肝癌SMMC-7721細胞的影響。

1 材料

1.1 藥物與試劑

陜重樓提取物單體A(BM-26)，由陜西中醫學院藥學院王昌利教授提供；順鉑注射液(齊魯制藥有限公司)；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(Sigma公司)；1640培養基(Gibco公司)；胎牛血清(Heclone公司)；胰蛋白酶消化液(西安舟鼎國公司)。

1.2 細胞

人肝癌SMMC-772l瘤株由中國醫學科學院藥物研究所引進，人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心提供。采用含有10%胎牛血清RPMI1640培養液，將人肝癌SMMC-7721細胞用貼壁細胞培養方式培養，置于37 ℃、5% CO2條件下，0.25%胰酶消化細胞，按1∶2 比例，2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 儀器

顯微鏡、普通光學顯微鏡(日本olympus公司)；TDZ4AWS臺式低速自動平衡離心機；恒溫培養箱(Heraeus公司)；96孔培養板(美國Corning公司)；酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測腫瘤細胞的生長

將SMMC-7721細胞按1×106/孔的密度接種于96孔培養板，每孔100 μL，培養24 h。實驗分為12組，分別為對照組、陽性組、給藥10個濃度梯度組。給藥組加入不同質量濃度的BM-26藥物，使其最終質量濃度分別為25、5、1 mg·mL-1，200、40、8、1.6、0.3、0.064、0.013 μg·mL-1；空白對照組加入與藥物等體積的PBS緩沖液；陽性組(順鉑)藥物最終質量濃度為30 μg·mL-1。每組設8個復孔，實驗重復3次，分別培養24、48、72 h，棄上清液；加入質量濃度為5 mg·mL-1的MTT(10 μL/孔)，繼續培養4 h，棄上清液；加入DMSO(100 μL/孔)，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀在570 nm處測吸收度，記錄吸光度值，計算細胞增殖抑制率IR，計算公式：IR=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。以抑制率(%)為縱坐標，藥物濃度為橫坐標繪制劑量—效應生長曲線，見圖1。

2.2 統計學處理

3 結果

3.1 對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響

24 h處理時，質量濃度為8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1組及陽性組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h處理時，質量濃度為0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1組及陽性組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h處理時，質量濃度為8、40 μg·mL-1組及陽性組與對照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中質量濃度為8 μg·mL-1時，在24、48、72 h吸光度最小，抑制率分別為45%、41%、36%。結果見表1、圖1。

表1 陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的影響

注：與模型對照組比較**P<0.01，*P<0.05。

圖1 陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對人肝癌SMMC-7721細胞抑制率的影響

4 討論

中藥抗腫瘤作用的研究已證實重樓醇提物有抗腫瘤、誘導凋亡等作用[3]。以此為參考，研究開發新的抗腫瘤藥物對肝癌的治療具有重要臨床意義。

重樓化學成分為甾體皂苷、游離氨基酸、植物甾醇、植物蛻皮激素、黃酮和少量的微量元素。其中甾體皂苷為其抗腫瘤有效成分，甾體骨架的不同使其抗腫瘤活性表現出明顯差異。甾體皂苷約占重樓總化合物的80%，其皂苷元多為薯蕷皂苷元，次為偏諾皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物，其中重樓皂苷為抗腫瘤有效成分[4]。

有研究者對滇重樓的乙酸乙酯和正丁醇萃取物進行了系統研究，從中分離多個化學單體，并考察了分離鑒定的單體化合物的抗腫瘤作用[5]。

近年來對滇重樓的抗腫瘤研究已經從其藥效作用深入到細胞毒性的作用，而對陜西重樓抗腫瘤藥理研究卻極少。李秦康[6]報導：陜西重樓乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位對S180、H22有一定的抑制作用，石油醚提取部位僅對H22有一定的抑制作用。筆者前期研究表明，陜重樓乙酸乙酯提取物可使肝癌SMMC-7721細胞系中Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白的表達上調，Bcl-2/Bax值降低，從而誘導腫瘤細胞的凋亡[7]。

陜重樓單體A(BM-26)為豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷屬甾體類皂苷。研究表明單體A質量濃度為8 μg·mL-1時，對人體肝癌SMMC-7721細胞的抑制作用最強，當劑量增加或降低時，抑瘤效果均降低，有效抑制濃度范圍是8～40 μg·mL-1。其作用原理有待進一步研究。

[1] 肖培根，楊世林.新編中藥志[M].北京：化學工業出版社，2002.704-711.

[2] 李世全，周大衛，楊光明.秦嶺巴山天然藥物志[M].陜西：陜西科學技術出版社，1987.245-246.

[3] 季申，周壇樹，張錦哲.中藥重樓和云南白藥中抗腫瘤細胞毒活性物質Gracillin的測定[J].中成藥，2001，23(2)：212-215.

[4] 王艷霞，李惠芬.重樓抗腫瘤作用研究[J].中草藥，2005，36(4)：628-6.

[5] 王羽，張彥軍，高文遠，等.滇重樓的抗腫瘤活性成分的研究[J].中國中藥雜志，2007，32(14)：1425-1428.

[6] 李秦康，王昌利.陜西重樓抗腫瘤活性成分研究[J].陜西中醫學院學報，2011，34(3)：46-47.

[7] 宋延平，楊潔，王偉，等.陜重樓提取物對人肝癌SMMC-7721細胞bcl-2和Bax基因表達的影響[J].陜西中醫，2013，34(4)：502-503.

Inhibiting effect of Rhizoma Parid Steroidal Saponins Monomer stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosideonProliferationofHumanhepatocarcinomaSMMC-7721Cells

ZHANG Yuchen1，SONG Yanping2*，WANG Changli1，WANG Wei1

(1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi xianyang 712046，China；2.Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，shaanxi Xi’an 710003，China)

Objective：To study the inhibitory effect of the Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside on the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells.Methods：The SMMC-7721 cells were treated with monomer A(BM-26)of different concentration in 24，48 and 72 hours respectively.MTT assay was applied to measure the inhibition ratio of proliferation，and the effect of A(BM-26)on proliferation of cancer cells was calculated.Results：A(BM-26)in different weight and concentration showed the inhibitory effect on SMMC-7721 cells.In 24 hours the absorbance A value of A(BM-26)in concentration of 8，40，200 μg·mL-1，1，5，25 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，in 48 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 0.3，1.6，8，40，200 μg·mL-1，1 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，and in 72 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 8，40 μg·mL-1was remarkably lower than that of the control group.The inhibiting effect was the highest with the concentration of 8 μg·mL-1.In 24 h，48 h，72 h inhibition rates were 45、41、36%，respectively.Conclusion：A(BM-26)has an certain inhibitory effect on SMMC-7721 cells，and the strongest inhibitory concentration is 8 μg·mL-1，and the effective inhibitory concentration ranges 8-40 μg·mL-1.

Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)；hunman liver cancer SMMC-7721 cells；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.008

2014-07-09)

陜西省中醫管理局中醫藥科研課題(NO.JC17)

*

宋延平，研究員，研究方向：腫瘤與心血管；E-mial：sypdd2003@163.com