丹參素、羥基紅花黃色素A單用及合用對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用△

胡天鑫，文愛東，朱艷榮，關月，趙潤懷

(1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.第四軍醫大學 西京醫院，陜西 西安 710032；3.中國中藥公司，北京 100195)

丹參素、羥基紅花黃色素A單用及合用對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用△

胡天鑫1，2，3，文愛東2，朱艷榮2，關月2，趙潤懷3*

(1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.第四軍醫大學 西京醫院，陜西 西安 710032；3.中國中藥公司，北京 100195)

目的：觀察丹參素、羥基紅花黃色素A單用及合用對大鼠心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)損傷的保護作用。方法：采用冠狀動脈左前降支結扎復制大鼠MI/R損傷模型，缺血30 min，再灌注180 min，再灌注即刻尾靜脈給藥。將36只SD大鼠隨機分為6組，每組6只，分別為假手術組、模型組、丹參素組(2 mg·kg-1)、羥基紅花黃色素A組(0.05 mg·kg-1)、丹紅注射液陽性對照組(2 mL·kg-1)及丹參素、羥基紅花黃色素A合用組[2.05 mg·kg-1，等同于丹紅注射液(DHI)中相應的含量]，假手術組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液(2 mL·kg-1)。再灌注結束后，伊文思藍(EB)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)雙染法測定心肌梗死面積；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)水平；試劑盒比色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)活力；肢體導聯ECG監測ST段變化。結果：造模后各組大鼠心梗面積、血清cTnI、LDH和CK-MB水平均有升高，與假手術組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組均可改善MI/R損傷；丹參素、羥基紅花黃色素A合用后大鼠心梗面積(P<0.05)、血清中CK-MB、cTnI、LDH的濃度顯著下降(P<0.05)。結論：丹參素、羥基紅花黃色素A對各項藥效指標均具有改善作用，兩者合用后在降低心梗面積、抑制cTnI、LDH和CK-MB水平方面作用加強，對MI/R損傷心肌起到增強保護的作用。

丹參素；羥基紅花黃色素A；合并用藥；心肌缺血再灌注損傷；酶聯免疫吸附試驗

冠心病是威脅人類健康的重大疾病，隨著冠脈內溶栓和冠脈搭橋等治療手段的廣泛應用，心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷導致心肌結構破壞加重，心肌壞死范圍擴大，影響冠心病患者的預后[1]。

中藥治療MI/R損傷療效確切、前景良好，其中以丹紅注射液的治療效果較好。丹紅注射液由丹參及紅花兩味中藥組成，其中丹參味苦，性微寒，為主藥；紅花味辛，性溫，為輔藥。紅花中已經明確的藥效成分主要包括羥基紅花黃色素A和紅花總黃色素；丹參中的藥效成分主要包括丹參酮類、丹酚酸類以及丹參素等[2-4]。目前對于丹參素和羥基紅花黃色素A藥理作用的研究較多，分別在抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面發揮心肌保護作用[5-11]，但丹參素與羥基紅花黃色素A合用對大鼠MI/R損傷保護作用的研究尚未見報道。本研究擬應用大鼠MI/R損傷模型，以陽性藥丹紅注射液作為對照，觀察丹參素與羥基紅花黃素A聯合應用對MI/R損傷的保護作用，為藥物聯合應用治療MI/R損傷提供新的思路和參考。

1 材料

1.1 儀器

HX-100E小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；TDZ4A-WS低速臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；680型酶標儀(Thermo Fisher，USA)；COOLPIX S1型照相機(Nikon公司)；BL-420S系列生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 試藥

丹參素(西安鴻生生物有限公司，批號：110516)；羥基紅花黃色素A(成都貝斯特試劑有限公司，批號：BRS011748)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA檢測試劑盒、肌鈣蛋白I(cTnI)ELISA檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；戊巴比妥鈉(Sigma，USA)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)染色劑(中國醫藥集團上海化學試劑公司)；伊文思藍(EB)(Sigma-Aldrich，USA)。

1.3 動物

清潔級雄性健康SD大鼠36只，體重220～260 g，動物許可證號：SCXK-(軍)2007-007，由第四軍醫大學動物中心提供。動物分籠飼養(溫度22～25 ℃，濕度50%～70%)，定時給予全價營養飼料喂食，術前12 h禁食，自由飲水。將大鼠隨機分為6個組，分別為假手術組、模型組、丹參素組、羥基紅花黃色素A組、合用組、丹紅注射液對照組，每組6只。

2 方法

2.1 給藥

假手術組：只穿刺不結扎，注射0.9%氯化鈉溶液(2 mL·kg-1)；模型組：注射0.9%氯化鈉溶液(2 mL·kg-1)；丹參素組：給予丹參素(2 mg·kg-1)；羥基紅花黃色素A組：給予羥基紅花黃色素A (0.05 mg·kg-1)；合用組：2.05 mg·kg-1(按照丹紅注射液中該成分含量制備[12-13])；陽性藥物對照組：丹紅注射液，給藥劑量為2 mL·kg-1。各組均于再灌注即刻給藥，所有注射藥液均用0.9%氯化鈉溶液稀釋，給藥方式均為尾靜脈給藥。

2.2 動物模型制作

將大鼠稱重，按2 mL·kg-1劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，仰臥位固定于專用木板上，連接生物機能實驗系統，監測心電，切開氣管，插入自制插管并用縫合線打結固定，連接小動物呼吸機(頻率：75次·min-1；潮氣量：8～9 mL；呼吸比為2∶1)，待大鼠心電圖正常后于胸骨左緣旁縱行切開，第3～5肋間做橫行切口開胸，撕開心包膜暴露心臟。以左心耳下緣、肺動脈圓錐左緣交界處的左冠狀動脈前降支為標志，左心耳下方1～2 mm處進針，橫跨左冠狀動脈前降支穿線，將硅膠套管從絲線兩端穿入，穩定10 min后結扎，結扎缺血30 min后剪開絲線，再灌注180 min結束。成功標準：結扎左冠狀動脈前降支后心電圖II導聯ST段出現向上抬高，T波高聳等為缺血成功；放松結扎線后抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功[14]。假手術組動物只穿線不結扎。實驗過程中大鼠處置方法符合動物倫理學標準要求。

2.3 心肌梗死面積測定

再灌注180 min后再次結扎各組大鼠左冠狀動脈前降支，從下腔靜脈迅速注入3%EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍染后迅速摘除心臟，0.9%氯化鈉溶液洗凈染液，濾紙吸干后-80 ℃凍存。取出后在心臟結扎線以下，平行于房室溝均勻地將心臟橫切成5片，選取相同位置即第三片進行染色，2%TTC溶液(pH=7.4)37 ℃孵育10 min，4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗死區(AN)，紅色代表缺血但未梗死區，藍色代表正常區，紅色和白色面積之和代表危險區(AAR)[15]。選定靠近結扎線一側為正面，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，梗死程度采用AN/AAR值表示。

2.4 心電圖采集

大鼠造模缺血30 min，剪斷絲線再灌注180 min，采用生物機能實驗系統下“心電”項，分別記錄各組大鼠正常心電圖，結扎后10、30 min心電圖，剪斷絲線再灌注10、60、180 min心電圖，每組讀取第一個ST段對應電壓值(mV)。

2.5 血清生化指標測定

再灌注180 min后，腹主動脈取血，室溫靜置30 min，離心(4 000 r·min-1)10 min，分離血清，按照試劑盒說明書方法檢測CK-MB、cTnI的含量以及LDH的活性，計算占DHI組藥效的百分比，公式為(模型組-給藥組)/(模型組-丹紅注射液組)×100%。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 丹參素、羥基紅花黃色素A單用及合用對大鼠心肌梗死面積的影響

大鼠缺血30 min，再灌注180 min后，模型組大鼠心肌出現明顯的梗死，AN/AAR為(47.4±4.36)%，與假手術組相比，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加(P<0.01)，表明MI/R損傷模型制作成功。模型給予丹參素、羥基紅花黃色素A、合用藥及丹紅注射液組的AN/AAR依次為(32.2±1.87)%、(32.8±2.04)%、(19.2±2.31)%、(15.4±1.29)%。丹參素與羥基紅花黃色素A合用相比于單用組能顯著降低MI/R損傷大鼠心肌梗死面積(P<0.05)，且合用相當于丹紅注射液藥效的(88.13±2.97)%。見圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，▲▲P<0.01；與合用組比較，△P<0.05圖1 各組大鼠心肌梗死程度(n=6)

3.2 丹參素、羥基紅花黃色素A及合用對MI/R大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平明顯增加(P<0.05)。丹參素、羥基紅花黃色素A及其合用組的大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平顯著下降，與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)。合用組大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平下降程度，與單用組相比差異有統計學意義(P<0.05)，且合用組相對于陽性藥丹紅注射液組各藥效的百分比均高于單獨給藥組相應的百分比。見表1。

表1 各組對大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI的影響

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01，△P<0.05；與合用組比較，#P<0.05。

3.3 各組大鼠心肌MI/R造模前后心電圖ST段的變化

結扎冠狀動脈后，各組大鼠心電圖ST段皆有一定的升高。剪開絲線再灌注后，丹參素組、羥基紅花黃色素A組、合用組及丹紅注射液組不同時刻ST段升高幅度均有一定程度下降，與結扎前相比差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 各組對大鼠心肌MI/R損傷后心電圖ST段的影響 mV

注：與結扎前比較，△P<0.05。

圖2 大鼠心肌MI/R造模前后心電圖ST段的變化

4 討論

冠心病是對人類生命威脅最大的疾病之一。雖然早期及時再灌注心臟是防止心肌組織缺血，造成進一步損害的有效方法，但缺血組織恢復血流灌注時，往往導致再灌注區域心肌細胞及局部血管網產生顯著的病理變化，而這些變化的共同作用可導致組織的進一步損傷，即MI/R損傷。本研究通過應用EB-TTC大鼠心肌標本雙染色法、心肌酶藥效指標證實了丹參素、羥基紅花黃色素A合用對大鼠MI/R損傷具有增強保護的作用。

梗死面積被認為是衡量MI/R損傷的金標準[16]。由于心肌梗死是不可逆損傷，通常采用AN/AAR值來說明MI/R的損傷程度。實驗造成MI/R損傷后，給予丹參素、羥基紅花黃色素A及其合用均能夠降低大鼠心梗面積(P<0.05)，并且數據統計顯示兩者合用能進一步降低心梗面積，可以達到使用丹紅注射液效果的88.1%，說明兩者在降低心梗面積作用中起到關鍵作用。心肌酶CK-MB、LDH和cTnI被認為是心肌細胞受損程度的重要標志酶[17]。缺血損傷心肌導致細胞膜通透性改變，細胞內CK-MB漏出增加。實驗造成大鼠急性再灌注損傷后，血清CK-MB升高，與假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。LDH和cTnI也在造模后較假手術組有明顯的升高(P<0.05)。丹參素、羥基紅花黃色素A及合用均能夠顯著降低由心肌受損引起的各項指標的升高(P<0.05)。同樣，兩者合用相比于陽性藥丹紅注射液組，在心肌酶指標降低的程度中貢獻大于單獨使用組(P<0.05)，說明兩者合用能夠增強保護作用，并且基本能夠代表丹紅注射液藥效的60%左右，在丹紅注射液發揮心肌保護中處于重要地位。急性心肌梗死進展期血管再通后，缺血心肌再灌注所致的室顫是冠心病人猝死的常見原因。動物心肌短暫缺血后，恢復血流供應也可導致嚴重的心律失常。ST段移位的電生理學基礎是正常組織和心肌缺血區之間出現的損傷電位差，電位差愈大，ST段抬高的程度愈大[4]。本實驗中，假手術只穿線不結扎，未見心電顯著異常，結扎后ST段明顯上抬(P<0.05)，再灌注后由于已對心肌產生損傷，故與正常心電相比存在差異。

綜上所述，本研究結果表明丹參素、羥基紅花黃色素A聯合給藥可以顯著減少大鼠心肌梗死面積，降低大鼠血清中CK-MB、LDH和cTnI的生成和釋放，聯合使用對再灌注損傷的改善具有增效作用。從一定程度上驗證了丹參、紅花兩味中藥的配伍制劑——丹紅注射液的藥效作用。但本實驗對丹參素和羥基紅花黃色素A合用產生增效保護作用的機制并未進行研究，仍需在以后的工作中進一步探討。

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ProtectiveEffectofDanshensuandHydrosafflorYellowAforUsingAloneorinCombinationonMyocardialIschemic-ReperfusionInjuryinRats

HU Tianxin1，2，3，WENAidong2，ZHUYanrong2，GUANYue2，ZHAORunhuai3*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China；2.DepartmentofPharmacy，XijingHospital，TheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；3.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China)

Objective：To investigate the protective effect of Danshensu and hydrosafflor yellow A for using alone or in combination on myocardial ischemic-reperfusion(MI/R)injury in rats.Methods：The MI/R injury model was produced by making a slipknot around left anterior descending coronary artery(LAD).After 30 min of ischemia，the slipknot was released and followed by 180 min of reperfusion.All drugs were administered via tail intravenously injection within 5min at the beginning of reperfusion.The SD rats were randomly divided into 6 groups(n=6，each group)：Sham group；Myocardial ischemic-reperfusion(MI/R)group；MI/R and Danshensu group(2 mg·kg-1)；MI/R and hydrosafflor yellow A group(0.05 mg·kg-1)；MI/R and Danhong injection(2 mL·kg-1)group；MI/R and combination groupof Danshensu，hydrosafflor yellow A(2.05 mg·kg-1，equalto the content of DHI).Sham group and MI/R group were administered saline(2 mL·kg-1)via tail intravenously injection.At the end of reperfusion，the infarct size was determined by 3% Evans Blue and 2% triphenyltetrazolium chloride staining；CK-MB，cTnI and LDH levels were measured using standard kits by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and visible spectrophotometry.ST change were monitoredby ECG with limb leads.Results：The infarct size，the level of CK-MB，LDH and cTnI in model group were remarkably higher than sham group(P<0.05).Compared with model group，every group of drug administered couldalleviate the MI/R injury，the combination group could significantly reduce the level of infarct size，CK-MB，LDH and cTnI(P<0.05).Conclusion：Danshensu and hydrosaffloryellow A both can alleviate the injury induced by myocardial ischemic-reperfusionin rats.The combination can enhance the protective effect on MI/Rinjury in rats.

Danshensu；hydrosafflow yellow A；drugcombination；myocardial ischemic-reperfusion injury；enzyme-linked immunosorbent assay

2014-06-23)

國家自然科學基金(81173514)

*

趙潤懷，研究員，研究方向：中藥資源與產品開發研究；Tel：(010)88468190，E-mail：zhaorunhuai@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.004