不同產地山羊角凝膠電泳指紋圖譜及其混偽品鑒別研究△

康馨元，劉睿，李春楠，孫佳明，張輝*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046)

不同產地山羊角凝膠電泳指紋圖譜及其混偽品鑒別研究△

康馨元1，劉睿2，李春楠1，孫佳明1，張輝1*

(1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046)

目的：研究建立不同產地山羊角藥材的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的指紋圖譜以及與混偽品的鑒別方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法對山羊角及其偽品的蛋白成分進行分析比較。結果：不同產地山羊角電泳圖譜相似，有5個共有帶峰，可作為山羊角的專屬條帶。結論：該方法簡單易行、靈敏度高，可為山羊角的產地鑒別及與偽品的鑒別提供參考。

山羊角；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；指紋圖譜

山羊角為牛科動物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角。其首載于《本草新編》，曰：“專活死血”[1]。山羊角味咸，性寒。無毒。具有清熱、鎮驚、散瘀止痛等功能。其成分主要有甾族、磷脂類、角蛋白、水溶性蛋白、多肽及氨基酸類成分[2-5]。《醫林纂要》記載“功用近羚羊角”。山羊角和羚羊角化學成分及藥理作用基本相同，均有解熱、鎮靜、催眠作用，山羊角的鎮靜作用稍強[6]。由于羚羊角數量稀少，藥材主要靠進口，故山羊角是羚羊角的理想替代品[7]。因此，本試驗收集10批不同產地山羊角樣品，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，通過凝膠電泳圖像分軟件和中藥指紋圖譜相似度軟件，進行了山羊角蛋白SDS-PAGE指紋圖譜研究，并與綿羊角、水牛角、牛蹄甲進行對比，旨在建立一種快速、簡便的山羊角專屬性鑒定方法，為山羊角藥材的鑒別及質量評價、與羚羊角蛋白質類的成分對比研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DYY-10C型電泳儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)；TGL-16B型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；BSA124S-CW電子天平、酸度計(賽多利斯科學儀器有限公司)；DSHZ-300A旋轉式恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；FD-1000真空冷凍干燥裝置(日本)；HS2060型超聲波清洗器(HENGAO T&D)；WP-UP-III-40超純水系統(四川沃特爾科技發展有限公司)。

1.2 試劑

丙烯酰胺(AMRESCO)；N-N甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(北京鼎國生物公司Genview分裝)；過硫酸銨(北京鼎國生物公司 Sigma分裝)；考馬斯亮藍G-250(北京鼎國生物公司)；Marker(TIANGEN)；β-巰基乙醇(Sigma)；TEMED(AMRESCO)；磷酸氫二鈉、甲醇、乙酸、鹽酸(北京化工廠)；去離子水。

1.3 材料

山羊角藥材來源于浙江、河北、江蘇、廣東、黑龍江、內蒙古、安徽7省共10個地區，由東豐制藥有限公司提供，由長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心張輝教授鑒定為牛科動物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，見表1。偽品包括水牛角(吉林大藥房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及綿羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角藥材來源

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取10批山羊角以及偽品粉末各0.5 g，放入乳缽，分別加裂解液(含8 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲)5 mL，研磨20 min，成勻漿，置離心管中(3000 r·min-1)離心20 min，取上清液，凍干，備用[4]。

2.2 SDS-PAGE法測定

2.2.1 電泳 將配制好的試劑按所需丙烯酰胺比例，配制12%分離膠溶液，待分離膠聚合后，在其上方灌注5%濃縮膠溶液，并立即插入干凈的樣品梳，注意避免氣泡產生。濃縮膠聚合完全后，小心移出樣品梳，把凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。取樣品凍干粉各約0.5 g，分別加入150 μL十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(未加二硫蘇糖醇)、20 μL巰基乙醇，加熱煮5 min以使蛋白變性。按預定順序加樣，每份樣品10 μL，由于供試品由尿素裂解液提取，變性后的樣品在室溫下極易凝固，故加樣過程需快速完成。接上電源，調節電壓(濃縮膠恒定電壓為70 V，分離膠恒定電壓為140 V)。樣品在電流的驅動下向前移動，待移動到前沿處即可停止。

2.2.2 染色、脫色及凝膠保存 預先配制考馬斯亮藍染液，即在1 g考馬斯亮藍中分別加入200 mL甲醇、50 mL冰醋酸和250 mL水，混勻。用至少5倍體積的染色液浸泡凝膠，放在數顯水浴恒溫振蕩器上，37 ℃平緩搖動，染色約4 h。將染色液替換成由甲醇-水-冰醋酸(9∶9∶2)配制成的脫色液，于數顯水浴恒溫振蕩器上37 ℃平緩搖動，直至條帶顯現但凝膠底色還稍顯藍色時取出凝膠，保存于水中，浸泡2 d后置于凝膠成像分析系統上進行分析。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性試驗 取產于河北安國的山羊角藥材按2.1方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、1、2、4、6、12、24 h觀察供試品溶液有無變化，并取樣進行SDS-PAGE試驗，考察主要共有蛋白帶的一致性。結果表明，供試品中各主要共有蛋白帶無缺失，在測定的24 h內穩定。

2.3.2 重復性試驗 取同一批山羊角藥材(河北安國)，按2.1方法分別制得5份供試品溶液，進行SDS-PAGE試驗，考察主要共有蛋白帶的一致性。通過LabWorks 4.6圖像捕獲/分析軟件進行分析，再經origin軟件積分峰面積，將數據導入到國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”中進行相似度分析。結果表明，相似度為0.993～0.997，說明本方法重復性良好。

2.3.3 精密度試驗 取同一批山羊角藥材(河北安國)，按2.1方法制備供試品溶液，在同一塊SDS-PAGE膠片上，取6次樣品間隔上樣，考察各共有蛋白帶的相對距離漂移情況。通過LabWorks 4.6圖像捕獲/分析軟件進行分析，再經origin軟件積分峰面積，將數據導入到國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”中進行相似度分析。結果表明，相似度為0.991～0.999，供試品進樣精密度良好。

2.4 SDS-PAGE指紋圖譜建立

2.4.1 對照指紋圖譜及相似度分析 將10批樣品及3批偽品的供試品溶液分別上樣，得到不同樣品蛋白的SDS-PAGE電泳膠片，見圖1。大部分山羊角樣品均明顯出現5條蛋白帶，相對分子質量分別約為63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa，其中60 KDa、46 KDa蛋白帶濃度相對較高。膠片經凝膠分析軟件生成圖譜后，采用Origin7.5軟件生成疊加圖，見圖2。將數據導入到國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”得到樣品的對照指紋圖譜及偽品指紋圖譜，見圖3～6。國家藥典委員會的“中藥指紋圖譜相似度評價系統(2004A)”軟件將10批樣品分別與對照圖譜比較，相似度除河北保定、廣東電白以及浙江紹興外均在0.800～1.000之間。以生成的對照圖譜為參照，計算得到偽品藥材綿羊角、牛蹄甲以及水牛角指紋圖譜，相對于對照圖譜的相似度均低于0.600，見表2。

a.浙江金華；b.江蘇盱眙；c.黑龍江雞西；d.內蒙古阿拉善；e.河北安國；f.浙江縉云；g.安徽合肥；h.Marker；i.浙江紹興；j.河北保定；k.廣東電白；l.牛蹄甲；m.水牛角；n.綿羊角。圖1 山羊角蛋白SDS-PAGE電泳膠片

注：1～10為不同產地山羊角樣品。圖2 10批山羊角樣品SDS-PAGE指紋圖譜疊加圖

注：1.分子質量為63 KDa；2.分子質量為60 KDa；3.分子質量為55 KDa；4.分子質量為51 KDa；5.分子質量為46 KDa。圖3 山羊角蛋白SDS-PAGE對照指紋圖譜

圖4 偽品綿羊角SDS-PAGE指紋圖譜

圖5 偽品牛蹄甲SDS-PAGE指紋圖譜

圖6 偽品水牛角SDS-PAGE指紋圖譜

表2 10批樣品及偽品相似度

2.4.2 特征指紋峰標定 在圖和表中可看出5個特征峰的相對遷移率Rf值分別為0.443 5、0.465 6、0.520 4、0.563 7、0.612 3。通過分子質量標準蛋白得到相對遷移率(Y)與相對分子質量(X)關系的標準曲線方程：Y=-0.009 4X+1.038(r=0.878 2)，根據標準曲線，分別得到5個共有帶峰的相對分子質量，見表3。將圖3按照相對遷移率可分為兩個區段：Rf值在0～0.540之間為第一區段，有1(63 KDa)、2(60 KDa)、3(55 KDa)三個蛋白帶峰，峰1和峰2為相對強峰，峰3在不同產地樣品圖譜中略有不同；Rf值在0.540～1.000之間為第二區段，有三個蛋白帶峰，但由于Rf值為0.800的蛋白帶峰較為彌散，不能作為獨立條帶，考慮為相對分子質量較小的蛋白，有待將山羊角蛋白進行砍段處理后進一步研究，故本實驗選擇該區段內4(51 KDa)、5(46 KDa)兩個蛋白帶峰作為特征帶峰，其中峰5為最強峰。

表3 SDS-PAGE凝膠電泳圖像的5個特征帶峰分析參數

3 討論

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在分離蛋白質、多肽等大分子方面具有高分辨率、高靈敏度、分析時間短、用量少等特點[8]，又因其穩定性、精密度、重現性較好而被廣泛應用[9]。本試驗借助聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對不同產地山羊角樣品進行了分離，并采用凝膠分析軟件與Origin軟件相結合的方法，將樣品電泳譜帶生成更加直觀的疊加圖，以專屬條帶數目、蛋白質電泳Rf值、蛋白質豐度等作為綜合評價指標，并通過相似度軟件進行相似度分析，通過技術參數提供更可靠的鑒別依據。為保證該方法的準確性，本試驗進行了方法學考察，結果表明SDS-PAGE電泳方法呈現良好的重復性、穩定性以及精密度。

從上述山羊角樣品指紋圖譜疊加圖可見，10批不同產地山羊角的SDS-PAGE指紋圖譜在譜帶位置、條數、帶型上無顯著性差異；產自河北安國的樣品有一特征譜帶，說明河北安國山羊角的蛋白組成具有一定的產地差異；河北保定、廣東電白以及浙江紹興樣品譜帶清晰度低于其他產地樣品，可能與樣品有效成分含量不同有關。將樣品圖譜導入到相似度軟件生成對照圖譜，從中清晰可見5條共有條帶，混偽品電泳圖譜與之相比差異較為顯著，因此可以將對照圖譜所顯示的5條特征條帶作為山羊角專屬條帶，相對分子質量分別約為63 KDa、60 KDa、55 KDa、51 KDa、46 KDa。

本研究方法建立的指紋圖譜可快速地對山羊角偽品與正品進行鑒別和區分，為山羊角藥材質量評價及控制，進一步完善和深入研究山羊角藥材的質量標準，與羚羊角蛋白質類的成分對比研究提供了參考依據。

[1] 孫寶森.動物角類的藥用研究概況[J].中醫藥信息，2004，21(3)：25.

[2] 劉力，張輝，胡嶸，等.山羊角研究概述[J].長春中醫學院學報，1994，10(5)：109.

[3] 楊清林，傅亞.山羊角提取物中氨基酸含量測定研究[J].中藥材，2011，34(7)：1023-1026.

[4] 劉炎，張貴君，張杰，等.中藥羚羊角及其類似品中水溶性蛋白的檢測[J].中華中醫藥雜志，2009，24(12)：1571-1574.

[5] 李江海，王伯初，王建，等.山羊角提取物中焦谷氨酸含量測定研究[J].藥物分析雜志，2011，31(8)：1567-1570.

[6] 李云谷.山羊角、黃羊角、羚羊角及其注射液的初步研究[J].草藥通訊，1979(5)：12.

[7] XU B，ZHANG H.The advance-ment of antelope’s horn and its substitutes research[J].J Chin Med Mater，2003，26(12)：910.

[8] 李桂蘭.苦杏仁及混偽品的可溶性蛋白質電泳鑒別[J].山西中醫學院學報，2006，17(1)：50.

[9] 杭悅宇，張垂勝，史蕓蕓.西洋參和人參的可溶蛋白電泳鑒別[J].植物資源與環境學報，2001，10(3)：59-60.

StudiesonSDS-PAGEFingerprintsChromatogramofCaprahireusfromDifferentAreasandItsAdulterants

KANG Xinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To establish the SDS-PAGE fingerprints and an identification method forCaprahireusL.collected from different areas and its adulterant.Methods：The SDS-PAGE method was adopted to compare the difference ofC.hireusand its adulterants.Results：It showed a similar electrophoretic patterns forC.Hireusof different origins.Five common peaks were determined as characteristic bands.Conclusion：The established method is simple and sensitive.It can provide the basis for identification of habitats and adulterants.

CaprahireusL.；SDS-PAGE；fingerprints

2014-08-15)

角類動物藥的標準制定項目——國家藥品標準提高暨2015版藥典科研任務(2012)

*

張輝，博士生導師，教授，研究方向：天然藥物化學；Tel：(0431)86172080，E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.005