HPLC測定復方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的含量△

尹紅衛，潘蘇華

(1.南京中醫藥大學 藥學院，南京 210023；2.上海卡樂康包衣技術有限公司，上海 201108)

HPLC測定復方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的含量△

尹紅衛1，2，潘蘇華1*

(1.南京中醫藥大學 藥學院，南京 210023；2.上海卡樂康包衣技術有限公司，上海 201108)

目的：建立復方銀杏葉刺梨膠囊銀杏黃酮醇苷的HPLC測定方法。方法：色譜柱為漢邦C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃。結果：槲皮素、山柰素、異鼠李素分別在12.8～63.8 μg·mL-1、12.9～64.4 μg·mL-1、2.6～13.2 μg·mL-1線性關系良好，平均回收率槲皮素為99.48 %，山柰素為102.69%，異鼠李素為100.15 %。結論：該測定方法簡便易行、準確性好、靈敏度高、重復性好，可用于復方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的質量控制。

復方；銀杏葉刺梨膠囊；黃酮醇苷；含量測定

近年來，高血脂并發癥有逐年上升的趨勢，高甘油三酯血癥作為高血脂中最常見的類型愈加被重視。目前降甘油三酯(TG)首選貝特類，但此類藥易引起轉氨酶升高、腹瀉、急性肝損傷等諸多不良反應。國外研究早就發現銀杏葉制劑有較好的降TG的作用，但是其中含有毒性物質銀杏酸(GA)，口服偶見有惡心、嘔吐等胃腸道不良反應或過敏反應[1]，市場缺乏安全有效的降TG藥物。復方銀杏葉刺梨膠囊采用具有健脾消食、保肝護肝的刺梨與銀杏葉提取物配伍，能有效降低銀杏酸的毒副作用[2]，更加有利于高血脂癥等老年性疾病的預防和治療。本研究采用HPLC對復方銀杏葉刺梨膠囊中的槲皮素、山柰素和異鼠李素3種銀杏葉萜黃酮醇苷進行定量分析，目的是建立一個能夠有效控制該膠囊內在質量的方法，以利于臨床更廣泛、更安全地使用。此方法簡單快捷，結果準確，專屬性強，可用于復方銀杏葉刺梨膠囊的質量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(G1311二元高壓梯度泵、G1329B脫氣機、1290 Infinity 二極管陣列檢測器、7693A自動進樣器，美國Agilent 公司)；AG285電子天平(0.01 mg，METTLER，SWITERLAND)；KQ-250DB型數顯超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)；TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 材料

對照品槲皮素、山柰素、異鼠李素(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為0081-9304，110861-200606，110860-200407；含量分別為98.1%，98.3%，98.4%)；銀杏葉提取物(江蘇富偉生化制品有限公司，批號：130616)；甲醇、鹽酸(AR，南京化學試劑有限公司，批號分別為060614871，061130589)；重蒸水(娃哈哈飲用純凈水)；磷酸(AR，上海久億化學試劑有限公司，批號：20130320)；明膠空心膠囊(藥用級，安徽黃山膠囊股份有限公司，批號：20130408)；復方銀杏葉刺梨膠囊(自制，批號分別為20140104，20140111，20140123)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL，理論板數按槲皮素峰計算不得低于2500。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品槲皮素(quercetin，Q)6.38 mg、山柰素(kaempferol，K)6.44 mg、異鼠李素(isorhamnetin，I)1.32 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得槲皮素、山柰素、異鼠李素質量濃度分別為63.8、64.4、13.2 μg·mL-1的標準儲備液，4 ℃冰箱保存備用。

2.3 供試品溶液的制備

取復方銀杏葉刺梨膠囊內容物1 g，精密稱定，加甲醇30 mL溶解，再加25%鹽酸溶液5 mL，置90 ℃水浴加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉移至50 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，于12 000 r·min-1離心15 min后即得，備用。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例制備不含銀杏葉提取物的陰性樣品，按照2.3方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

精密量取槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品溶液，供試品溶液，陰性對照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，結果見圖1。可見供試品與槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品相應位置有吸收，而陰性對照無吸收，表明其他成分對銀杏黃酮醇苷的測定無干擾。

1.槲皮素；2.山柰素；3.異鼠李素A.混合對照品；B.復方銀杏葉刺梨膠囊供試品；C.刺梨陰性供試品。圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.6 線性關系考察

分別精密吸取2.2的槲皮素、山柰素、異鼠李素標準儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各對照品溶液分別進樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為槲皮素：Y=13 547X+1.947 6，r=0.999 9；山柰素：Y=12 593X-7.085 7，r=0.999 7；異鼠李素：Y=13 447X-2.933 3，r=0.999 4。結果表明槲皮素在12.8～63.8 μg·mL-1，山柰素在12.9～64.4 μg·mL-1，異鼠李素在2.64～13.2 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.7 精密度試驗

取2.2標準儲備液，按2.1色譜條件連續進樣6次，測定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.38%、0.69%、2.31%，表明儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取復方銀杏葉刺梨膠囊(批號：20140104)內容物，按2.3方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、6、8、10 h進樣，測定峰面積。結果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.87%、0.68%、1.17%，表明供試品溶液在室溫條件下放置10 h內基本穩定。

2.9 重復性試驗

取復方銀杏葉刺梨膠囊(批號：20140104)內容物，平行6份，按2.3方法分別制備供試品溶液，依法測定，結果復方銀杏葉刺梨膠囊中槲皮素、山柰素、異鼠李素的質量分數分別為8.72 mg·g-1、5.68 mg·g-1、1.28 mg·g-1，RSD分別為1.7%、1.5%、1.8%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收試驗

精密稱取復方銀杏葉刺梨膠囊(批號：20140104)內容物約0.36 g，共6份，加入槲皮素對照品溶液(63.8 μg·mL-1)12 mL、山柰素對照品溶液(64.4 μg·mL-1)8 mL、異鼠李素對照品溶液(13.2 μg·mL-1)9 mL，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定峰面積，計算回收率，結果槲皮素的平均回收率為99.48%，RSD值為2.74%；山柰素的平均回收率為102.69%，RSD值為1.35%；異鼠李素的平均回收率為100.15%，RSD值為2.81%，表明該方法的準確度良好。加樣回收率數據見表1～3。

表1 槲皮素的回收率考察

表2 山柰素回收率考察

表3 異鼠李素回收率考察

2.11 樣品測定

取3批復方銀杏葉刺梨膠囊(批號分別為20140104，20140123，20140111)，按2.3方法制備供試品溶液，依法進樣并測定槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰面積，依照《中華人民共和國藥典》2010版規定，銀杏黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51[3]。結果見表4。

表4 復方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮的含量測定結果(n=3)

3 討論

本試驗中銀杏總黃酮醇苷的含量測定是通過3個黃酮單體的含量換算而來的。銀杏葉提取物中大部分黃酮苷類化合物的水解產物為槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮苷元，刺梨汁粉水解產物中黃酮苷類成分主要是以楊梅素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷元[4-5]。復方銀杏葉刺梨膠囊中刺梨的用量較低[6]，比較發現陰性制劑中刺梨水解后生成的槲皮素等成分含量極低，經測定其含量小于各待測成分含量的1%，對復方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏葉總黃酮醇苷的含量測定產生的干擾可忽略。

本研究參考《中華人民共和國藥典》2010版一部，銀杏葉項下總黃酮苷含量測定方法，以甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)為流動相測定復方銀杏葉刺梨膠囊中總黃酮醇苷含量，各成分的分離效果良好，符合中藥質量分析要求。

試驗結果表明，該方法簡便可行，靈敏度高，重復性好，可為復方銀杏葉刺梨膠囊的質量控制提供參考。

[1] 王琛，李昌煜.銀杏葉提取物藥理作用研究新進展[J].中國現代中藥，2009，11(3)：10-12.

[2] 潘蘇華，吳麗.復方銀杏葉制劑配伍減毒初步研究[J].南京中醫藥大學學報，2007，23(6)：389-390

[3] 國家藥典委員會，中華人民共和國藥典：一部[S]北京，中國醫藥科技出版社，2010：904-905.

[4] 鄧朝暉.HPLC法測定復方銀杏葉膠囊中總黃酮醇苷的含量[J].解放軍藥學學報，2008，24(3)：249-250.

[5] 李利鋒，孫國祥.銀杏葉片HPLC定量指紋圖譜和4個成分含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(12)：52-56.

[6] 董玉中，潘蘇華，張麗.HPLC法比較與不同比例刺梨汁配伍前后銀杏酸的含量變化[J].黑龍江醫藥，2009，22(5)：601-602.

DeterminationofflavonolglycosidesinCompoundGinkgoandRosaroxburghiicapsule

YIN Hongwei1，2，PANSuhua1*

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanghaicoloronCoLtd，Shanghai201108，China)

Objective：To determine the content of flavonol glycosides in Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.Methods：The HPLC method was established for the determination of the flavonol glycosides in Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.The HPLC was performed on Hanban C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)column，mobile phase consisted methanol -0.4% phosphoric acid(50∶50).column temperature 30 ℃，and flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 360nm.Results：A good linearity was obtained in the range of 12.8-63.8 μg·mL-1of quercetin，12.9-64.4 μg·mL-1of kaempferide and 2.6-13.2 μg·mL-1of isorhamnetin.The average recovery rates of quercetin，kaempferide and isorhamnetin were 99.48%，102.69 % and 100.15 %，respectively.Conclusion：The established method is simple，accurate and sensitive，and suitable for quality control of Compound Ginkgo and Rosa roxburghii capsule.

Compound；Ginkgo and Rosa roxburghii capsule；flavonol glycosides；determination

2014-10-14)

江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(2011ZYX6-010)

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潘蘇華，教授，碩士研究生導師；研究方向：中藥藥理及保健產品研發，E-mail：13851664089@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.014