HPLC同時(shí)測(cè)定加味逍遙丸中梔子苷和芍藥苷的含量

楊慶勝，馮朝嶺，司根令

(1.河南省醫(yī)藥藥材有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南漢方藥業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450003)

HPLC同時(shí)測(cè)定加味逍遙丸中梔子苷和芍藥苷的含量

楊慶勝1，2*，馮朝嶺1，司根令2

(1.河南省醫(yī)藥藥材有限公司，河南 鄭州 450003；2.河南漢方藥業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450003)

目的：建立加味逍遙丸中梔子苷、芍藥苷的含量測(cè)定方法。方法：高效液相色譜法，色譜柱為KromasilC18；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為10 μL；室溫；流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：梔子苷在0.24～2.16 μg進(jìn)樣量與峰面積間呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 6，平均回收率為99.29%；芍藥苷在0.12～1.08 μg進(jìn)樣量與峰面積間呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 7，平均回收率為99.62%。符合測(cè)定方法學(xué)研究的要求。結(jié)論：本方法操作方便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為該制劑的含量測(cè)定方法。

加味逍遙丸；梔子苷；芍藥苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

加味逍遙丸是收載于《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》2010版一部的品種，處方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)(麩炒)、茯苓、甘草、牡丹皮、梔子(姜炙)、薄荷九味中藥組成，具有舒肝清熱、健脾養(yǎng)血的功能，用于肝郁血虛、肝脾不和、兩脅脹痛、頭暈?zāi)垦！⒕氲∈成佟⒃陆?jīng)不調(diào)、臍腹脹痛[1]。梔子苷、芍藥苷分別為梔子、白芍的特征性有效成分，梔子苷、芍藥苷是加味逍遙丸的活性成分之一。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有芍藥苷的含量測(cè)定，為了控制加味逍遙丸的質(zhì)量，保證其療效，在對(duì)該品種進(jìn)行研究提高的過程中，采用高效液相色譜法，同一條件下測(cè)定梔子苷、芍藥苷在該制劑中的含量，并對(duì)測(cè)定方法學(xué)進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

FA-2004型電子分析天平(上海上平儀器公司)；KG3200超聲波振蕩器(昆山市超聲波儀器有限公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent化學(xué)工作站(美國(guó))。

1.2 試劑

梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201115，)；芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201035)；加味逍遙丸三批樣品為項(xiàng)目研發(fā)時(shí)自制(批號(hào)分別為130619，130622，130625)；缺梔子、白芍、牡丹皮的陰性樣品也為自制；乙腈為色譜純(天津四友公司)，其它試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為KromasilC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取梔子苷對(duì)照品30 mg、芍藥苷對(duì)照品15 mg，同置于250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得梔子苷質(zhì)量濃度為120 μg·mL-1、芍藥苷質(zhì)量濃度為60 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取加味逍遙丸5 g，研細(xì)，混勻，取細(xì)粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，浸漬過夜，超聲處理(功率為260 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

取缺白芍、牡丹皮、梔子的處方藥材，按加味逍遙丸制備工藝制成缺白芍、牡丹皮、梔子的陰性樣品，按2.3方法制備陰性樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、6、10、14、18 μL，注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(X)與對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)作回歸處理，得到芍藥苷回歸方程為Y=1709.717X+27.910，r=0.999 7；梔子苷回歸方程為Y=1646.308X+66.086，r=0.999 6。結(jié)果表明，芍藥苷在0.12～1.08 μg、梔子苷在0.24～2.16 μg進(jìn)樣量與峰面積間均具有良好的線性關(guān)系。

2.6 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，從色譜圖中可以看出，本測(cè)定條件的專屬性強(qiáng)，陰性樣品對(duì)芍藥苷、梔子苷的含量測(cè)定無干擾。見圖1～3。

圖1 梔子苷、芍藥苷對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定芍藥苷、梔子苷的峰面積積分值，芍藥苷RSD=1.16%(n=6)；梔子苷RSD=1.39%(n=6)。表明本法精密度較好，符合定量分析要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：130622)，分別于0、2、4、6、8、10 h各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定芍藥苷、梔子苷的峰面積積分值，芍藥苷RSD=1.28%(n=6)；梔子苷RSD=1.32%(n=6)。表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品(批號(hào)：130622)，按2.3方法平行制備5份供試品溶液，各吸取10 μL，分別注入液相色譜儀，進(jìn)行含量測(cè)定，梔子苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.561 8 mg·g-1，RSD=1.42%；芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.281 2 mg·g-1，RSD=1.36%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一供試品(批號(hào)：130622)細(xì)粉6份，每份約5 g，研細(xì)，混勻，分別取細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份分別精密加入混合對(duì)照品溶液稀釋液50 mL(精密吸取上述對(duì)照品混合溶液20 mL，用甲醇稀釋至50 mL，即得。稀釋液中梔子苷質(zhì)量濃度為48 μg·mL-1、芍藥苷質(zhì)量濃度為24 μg·mL-1)，余下按2.3方法操作，分別吸取供試品液各10 μL，按2.1色譜條件，分別測(cè)定梔子苷、芍藥苷的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1、表2。

表1 梔子苷加樣回收率試驗(yàn)

表2 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)

2.11 供試樣品的含量測(cè)定

分別取不同批號(hào)的樣品，按2.3方法制備。精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1色譜條件分別測(cè)定各樣品中梔子苷和芍藥苷的含量，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 三批供試品中梔子苷和芍藥苷的含量測(cè)定結(jié)果

注：加味逍遙丸規(guī)格為6 g/袋。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)資料[1]顯示，梔子苷、芍藥苷二者的檢測(cè)波長(zhǎng)非常接近，為了確保檢測(cè)的靈敏度，本研究對(duì)梔子苷、芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)行了紫外掃描分析，結(jié)果波長(zhǎng)為230 nm，兩者的檢測(cè)靈敏度均較好，峰形好，峰面積變化較小，故本研究選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本研究曾選用不同比例的乙腈-水[1]、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液[2]、乙腈-0.1%磷酸溶液[3]、乙腈-0.1%醋酸溶液[4]、甲醇-0.2%磷酸溶液[5]等系統(tǒng)為流動(dòng)相作了系統(tǒng)地比較，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)作為流動(dòng)相時(shí)，梔子苷、芍藥苷峰形較好，分離度也好。因此，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)作為流動(dòng)相。

3.3 溶劑和超聲時(shí)間的選擇

本研究在供試品溶液的制備過程中，曾選用甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇四種溶劑分別超聲處理20 min，結(jié)果四種溶劑所得供試液色譜基本一致，以甲醇為溶劑測(cè)定的含量最高。再以甲醇為溶劑分別超聲處理20、30、40 min，結(jié)果超聲處理30 min與超聲處理40 min的供試液測(cè)定值高于超聲處理20 min的測(cè)定值，但二者基本相同，故確定以甲醇超聲處理30 min作為制備供試品溶液的條件。

3.4本研究按照測(cè)定方法學(xué)研究的要求，對(duì)加味逍遙丸中梔子苷、芍藥苷的含量測(cè)定過程中的色譜條件、線性關(guān)系、專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等因素條件分別進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，本方法操作方便，線性關(guān)系良好，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，加樣回收率符合要求，可作為該制劑的含量測(cè)定方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部 [S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：96-97，231-232，667-668.

[2] 王玉鵬，趙麗華，王杰松.高效液相色譜法測(cè)定調(diào)經(jīng)活血片中芍藥苷的含量[J].武警醫(yī)學(xué)，2008，19(07)：617-618.

[3] 周卿，兌丹華，代廣會(huì)，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定清胰湯顆粒中梔子苷、芍藥苷的含量[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32(3)：268-270.

[4] 周瑾，莊惠清.HPLC法測(cè)定丹梔逍遙丸中梔子苷和芍藥苷的含量[J].中國(guó)藥事，2007，21(7)：495-497.

[5] 趙江紅，董文玲，劉伏先，等.HPLC法測(cè)定降脂排毒片中梔子苷的含量[J].中醫(yī)研究，2011，24(11)：26-28.

DeterminationofGeniposideandPaenoiflorininJiaweiXiaoyaoWanbyHPLC

YANG Qingsheng1，2*，F(xiàn)ENGChaoling1，SIGenling2

(1.HenanPharmaceuticalMedicinesCo.，Ltd，Zhengzhou450003，China；2.HenanHanfangPharmaceuticalCo.，Ltd，Zhengzhou450003，China)

Objective：To establish a method for determination of geniposide and paenoiflorin in Jiawei Xiaoyao Wan.Methods：The separation was performed on Kromasil C18column at 25 ℃，using acetonitrile -0.1% phosphoric(15∶85)as a mobile phase，injecting amount 10μL，the flow rate was 1.0 mL·min-1，the UV detection wavelength was 230 nm.Results：Geniposide showed a good linear relationship in range of 0.24-2.16 μg，r=0.999 6，the average recovery was 99.29%.Paenoiflorin showed a good linear relationship in range of 0.12-1.08 μg，r=0.999 7，the average recovery was 99.62%.Conclusion：The method is sample，accurate and practical，and suitable for the determination of Jiawei Xiaoyao Wan.

Jiawei Xiaoyao Wan；geniposide；paenoiflorin；HPLC；determination

2014-04-10)

*

楊慶勝，男，副主任藥師，研究方向：中藥的成分分析與新產(chǎn)品開發(fā)； Tel：(0371)60986969，E-mail：yangqsheng@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.016