不同生長時期丹參生物量積累及活性成分的變化規律△

趙志剛，郜舒蕊，謝景，閆濱濱，侯俊玲*，王文全，2，3*，宋嬿，張現明，李軍

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102；4.上海華宇藥業有限公司，上海 200002； 5.臨沂市龍康藥業有限公司，山東 臨沂 273300)

·中藥農業·

不同生長時期丹參生物量積累及活性成分的變化規律△

趙志剛1，郜舒蕊1，謝景1，閆濱濱1，侯俊玲1*，王文全1，2，3*，宋嬿4，張現明5，李軍5

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102；4.上海華宇藥業有限公司，上海 200002； 5.臨沂市龍康藥業有限公司，山東 臨沂 273300)

研究丹參移栽后不同生長時期根生物量積累及4種活性成分的動態變化規律，為丹參的規范化栽培提供理論依據。丹參移栽成活后，在不同的生長階段進行動態取樣，測定各時期丹參根部干物質的量及4種活性成分迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA的量，分析全生育期內丹參根生物量及4種活性成分的積累規律，并探討各成分單株總量及丹酚酸B與隱丹參酮、丹參酮IIA量比值的變化規律。結果表明：在整個生育期內，丹參根部干物質積累呈“慢-快-慢-快”的變化趨勢，折干率呈“M”形變化；相同類別活性成分具有較相似的變化規律，各成分量的最大值多出現在根部營養生長初期，而在傳統采收期—枯黃期，4種活性成分的量均有不同程度的降低；丹酚酸B與隱丹參酮、丹參酮ⅡA量的比值在8月初便趨于穩定，并一直持續至翌年展葉期；4種活性成分的總量，在整個生育期內具有相似的變化規律，在枯黃期均有所降低，翌年返青時又逐漸升高。明確了不同生長時期丹參根生物量及4種活性成分的積累規律，綜合考慮丹參藥材產量及活性成分含量，丹參的采收宜在春季萌芽前進行。

丹參；生物量；活性成分；生長時期；采收期

丹參SalviamiltiorrhizaBunge.為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，其干燥的根及根莖是著名活血化瘀中藥丹參的重要來源。丹參為臨床常用中藥，也是國家藥品標準收載的320多個中成藥的重要原料[1]。由于丹參在治療心腦血管疾病方面療效顯著，促使市場對原料藥材及中成藥制品的需求量不斷攀升，為緩解供需矛盾，從20世紀60年代開始各地紛紛對丹參進行引種栽培[2]。近年來，丹參的人工種植面積逐年增大，栽培丹參已成為商品丹參的主要來源。筆者對四川、山東、河南、陜西等丹參主產區實地考察后發現，各產區對于丹參的栽培管理仍多停留于傳統經驗上，缺乏科學的理論指導，造成各地丹參藥材質量參差不齊。中藥材規范化生產是藥材質量穩定、可控的重要保證，規范化的標準操作規程的制定要依據其生長動態的變化特點，只要抓住全生育期不同生長階段的變化特征，就可以有的放矢地加以管理，因此對丹參生長動態的研究非常必要。

本試驗研究了丹參生長過程中單株干物質積累以及迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA量的動態變化，并從4種活性成分總量及丹酚酸B與隱丹參酮、丹參酮ⅡA量的比值方面進行了初步探討，以期為丹參的規范化栽培提供理論依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

試驗于2012年4月至2013年4月在上海華宇藥業有限公司山東臨朐丹參規范化生產核心試驗示范基地進行。試驗所用丹參種苗來自育苗基地2011年7月所育的露地越冬苗，選用的種苗規格保持一致，經北京中醫藥大學王文全教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參S.miltiorrhizaBge.。試驗采用單因素隨機區組設計，小區面積2×3 m2，3次重復。丹參移栽采用起壟方式，穴栽，壟寬80 cm，每壟栽植雙行，三角定苗，株距保持20～25 cm，移栽前結合整地施入N-P-K(15∶15∶15)復合肥及生物有機肥各750 kg·hm-2作基肥，丹參生長期間的田間管理按照常規方法進行。

丹參生長1個月后開始進行動態取樣，各小區按照五點取樣法采集，每個點3～4株，每小區15～20株，約每月取樣一次，取樣時間及生長發育時期劃分見表1。取樣時將丹參根部全部挖出，去掉地上部分及泥土后單株編號，稱鮮質量；帶回實驗室于50 ℃烘箱中干燥，稱干質量，并計算折干率。將干燥后的樣品切段，四分法取樣，粉碎，過40目篩后置干燥器中備用。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(LC—2010AHT，島津公司)；KQ500DE型數控超聲波清洗器(功率：500 W，昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)；BP211D型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.3 試劑

迷迭香酸對照品(批號：120925)、丹酚酸B對照品(批號：121020)、隱丹參酮對照品(批號：120925)、丹參酮ⅡA對照品(批號：121029)，均購自上海融禾醫藥科技有限公司，質量分數均大于98%；甲醇、磷酸均為色譜純(美國Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水；乙醇及其他試劑均為分析純(北京化工廠)。

2 方法

2.1 測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取丹參藥材粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，超聲提取10 min(250 W，25 ℃)，放冷，75%乙醇補足減失的質量，取上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

表1 取樣時間及生長時期劃分

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取4種對照品，加甲醇配制成每1 mL含0.105 mg迷迭香酸、0.264 mg丹酚酸B、0.107 mg隱丹參酮、0.096 mg丹參酮ⅡA的儲備液。精密吸取迷迭香酸儲備液1.2 mL至10 mL容量瓶中，加30%甲醇定容，制成5.04×10-3mg·mL-1的迷迭香酸對照品溶液；精密吸取隱丹參酮儲備液2 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成2.14×10-2mg·mL-1的隱丹參酮對照品溶液；精密吸取丹參酮ⅡA儲備液2.5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成2.4×10-2mg·mL-1的丹參酮ⅡA對照品溶液；丹酚酸B儲備液不予稀釋，直接作為對照品溶液。將上述對照品溶液置于4 ℃冰箱中備用。

2.1.3 色譜條件 Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.01%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～3 min、30% A，3～5 min、30%～40% A，5～3 min、40% A，13～20 min、40%～58% A，20～22 min、58%～75% A，22～24 min、75% A，24～50 min、75%～85% A)；體積流量1.0 mL·min-1；檢測波長286 nm(迷迭香酸和丹酚酸B)和268 nm(隱丹參酮和丹參酮ⅡA)；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。對照品及供試品色譜圖見圖1。

1.迷迭香酸；2.丹酚酸B；3.隱丹參酮；4.丹參酮ⅡA。圖1 對照品(A)和樣品(B)的HPLC圖

2.1.4 方法學考察 精密度、穩定性、重復性和加樣回收試驗等方法學考察，結果均良好。

2.1.5 樣品的測定 采用HPLC測定迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的量后求得各生長時期4種活性成分的單株總量，各活性成分單株總量計算公式為：活性成分單株總量(mg)=單株根中各活性成分的量(%)×單株根干質量(mg)，以及丹酚酸B與隱丹參酮、丹酚酸B與丹參酮ⅡA量的比值。

2.2 統計分析

運用SPSS19.0和SIGMAPLOT11.1統計軟件對試驗結果進行統計分析及圖表制作。

3 結果與分析

3.1 不同生長時期丹參根部生物量積累及折干率動態變化

從丹參移栽成活至翌年萌芽前，其根部生物量積累基本呈現“慢-快-慢-快”的變化過程(圖2)。丹參在4月中旬移栽后至8月上旬，根干重一直處于緩慢增長狀態，干物質積累增加較少；進入8月份，氣溫逐漸下降，晝夜溫差不斷增大，丹參地上部分形態基本固定，其進行光合作用制造的有機物開始向下轉移，從而進入根部的快速生長期，根干物質快速積累，這一階段一直持續到10月份；之后，隨著氣溫的繼續下降，植株葉片光合作用的功能下降，根部生長趨于緩慢；翌年，丹參萌芽前其單株平均根干重又有小幅增長，較枯黃期增加了28.04%；隨著氣溫升高，丹參開始萌發新芽，根部營養供應地上部分的生長，因此，丹參根部干物質在這一階段又有所降低。

圖2 不同生長時期丹參生物量積累及折干率動態變化

在整個生長期內，丹參根部折干率基本呈“M”形變化趨勢(圖2)。丹參移栽成活后，隨著根生物量的不斷積累，折干率逐漸增大，至地上部分營養生長末期達到最大值，為34.17%。8月進入根部生長旺盛初期，這一階段雨水充沛，根組織膨大占據主導地位，根部伸長、增粗加快，但該時期根部折干率有較大幅度降低，僅為28.73%。此后，隨著根部有機物質積累的不斷加快，折干率又逐漸增大，至11月中旬丹參地上部分進入枯黃期即傳統采收期，此時折干率達到第二峰值，為33.00%。從枯黃期至翌年萌芽前期，丹參根折干率基本不變，但翌年植株萌芽后便有所降低，展葉期丹參根部折干率為29.04%。

3.2 不同生長時期丹參中4種活性成分量的動態變化

丹參藥材主要含有兩大類活性成分，一類是以丹酚酸B為代表的酚酸類成分，一類是以丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分。由圖3可知，兩類活性成分，除在移栽成活后的初始階段變化不同外，在其余生長階段具有相似的變化規律。酚酸類成分的動態積累基本呈“W”形，丹酚酸B在5月中旬即植株盛花期量最高，并且這一時期也是整個生長發育階段其含量的最高點，為14.72%，之后便迅速降低，到7月中旬降至最低點，為6.38%，二者相差1.31倍。隨著生長發育進程的推進，丹酚酸B又開始快速積累，8月上旬至9月上旬其含量相對穩定。進入根部快速生長期后，丹酚酸B的量又不斷降低，這一降低趨勢一直持續到11月中旬即枯黃期，翌年隨著新芽萌動其含量又開始逐漸升高，至4月上旬丹酚酸B的量為12.98%。迷迭香酸的變化趨勢與丹酚酸B相似，其含量最高值出現在7月中旬，高達1.18%，而最低點則出現在11月中旬枯黃期，僅為0.28%，二者相差3.21倍，翌年返青后其含量又開始升高，至4月上旬迷迭香酸的量為0.49%。

圖3 不同生長時期丹參中4種活性成分量的動態變化

在丹參整個生長時期內，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的動態積累呈現極為相似的變化趨勢。從5月中旬至9月上旬，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的量不斷積累增加，至9月上旬二者的量均到達最高值，由初始的0.13%、0.27%升高至0.84%和0.79%，分別增加了5.46倍和1.93倍。之后，隨著根部的快速生長，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的量又出現較大幅度的降低，一直持續到11月中旬枯黃期，翌年，隨著新芽萌動二者的量又開始逐漸升高，這一變化趨勢與丹酚酸B極為相似，至翌年展葉期隱丹參酮和丹參酮ⅡA的量分別為0.77%和0.67%。

3.3 不同生長時期丹參中丹酚酸B與隱丹參酮及丹參酮ⅡA量比值的動態變化

由圖4可知，在整個生長期內，丹酚酸B與隱丹參酮、丹參酮ⅡA量的比值均呈現“L”形變化趨勢。丹參移栽成活后的初期，丹酚酸B量最高，而隱丹參酮與丹參酮ⅡA的量最低，丹酚酸B與二者的比值分別為113.23、54.52。隨著丹參生長進程的推進，丹酚酸B的量迅速降低，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的量逐漸升高，丹酚酸B與隱丹參酮和丹參酮ⅡA量的比值趨于穩定，從8月初開始一直持續到翌年展葉期。經方差分析，丹酚酸B與隱丹參酮和丹參酮ⅡA量的比值在6個時期內無顯著差異，其平均值分別為16.59和18.37。

圖4 不同生長時期丹酚酸B與隱丹參酮及丹參酮ⅡA量比值的動態變化

3.4 不同生長時期丹參中4種活性成分總量的動態變化

在丹參整個生長期內，4種成分單株總量的變化趨勢相似(見圖5)。5月中旬至7月中旬為4種成分單株總量的緩慢增長期，這一階段4種成分單株總量的增幅均較小；但7月中旬之后則進入快速增長期，至9月下旬，即丹參根部速生末期達到高峰，之后隨著地上部分逐漸枯萎及根部生長停滯，4種成分單株總量又有所降低，其中，丹酚酸B和迷迭香酸單株總量較高峰期分別降低了53.83%和63.95%，隱丹參酮和丹參酮ⅡA分別降低了70.74%和76.38%。經過冬季休眠，翌年萌芽后4種成分的單株總量又開始逐漸增加，到4月上旬展葉期達到第2個高峰，迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮及丹參酮ⅡA的單株總量分別為2.30×102mg、6.05×103mg、3.50×102mg和3.10×102mg。

圖5 不同生長時期丹參中4種活性成分總量的動態變化

4 討論

4.1 移栽后丹參全生育期內的生長特點

植物的細胞、組織、器官具有一定的生長相關性，它們之間既有密切的協調，又有明確的分工，

既相互促進有彼此抑制[3]。田間觀察發現，丹參移栽成活后，在很長一段時間內主要進行地上部分的生長，包括營養生長和生殖生長，這個階段從丹參移栽成活一直持續至8月，此間氣溫高、光照強度大，葉片光合作用強，有利于地上部分的生長，該階段丹參根部生長緩慢，干物質積累較少。植物地上部分和根系是一個有機的整體，相互協調，不可分割，地上部分充足的營養生長是根部生長的必要準備。進入8月份，隨著生殖生長的結束，丹參的營養生長中心逐漸轉入根部，進入根部快速生長期，這個階段土溫適宜，晝夜氣溫溫差加大，有利于根部的膨大增粗，丹參根干物質快速積累，該階段一直持續至10月，之后隨著氣溫的繼續下降，地上部分趨于衰老，葉片光合作用降低，根部生長緩慢。劉紅云[4]采用Logistic曲線方程將丹參根的生長分為3個階段，認為丹參根干重的增長規律符合S型曲線，8～10月為丹參根部的快速生長期，這一點與本研究結果一致。本研究在丹參傳統采收期后，又對第二年萌芽前后其根部的生長變化進行了觀測，發現第二年丹參萌芽前其根部干物質還會出現一次小幅增長，萌芽前期丹參根干重較枯黃期提高了28.04%。隨著氣溫的升高，丹參開始萌芽，這時主要靠根部提供營養，萌芽階段丹參根部干物質有所下降，待葉片展開后便可以進行光合作用，進而開始地上部分的生長。

丹參的藥用部位主要為根，因此，在栽培過程中要充分利用其根部的快速增長期，采取適當的田間管理措施，如施肥、灌溉等以促進其快速生長期的生長，這樣可以以最低的經濟成本獲得最佳的經濟效益。

4.2 初步認為丹參的適宜采收時間為春季萌芽前

在中藥材實際生產過程中，適宜的采收時間和年齡是影響藥材產量與質量的關鍵環節[5]。《名醫別錄》記載：“其根物多以二月、八月采者，謂春初津潤始萌，未充枝葉，勢力淳濃也；至秋枝葉干枯，津潤歸流于下也。大抵春寧宜早，秋寧宜晚，花、實、莖、葉，各隨其成熟爾”。可見，制定中藥材合理的采收計劃需要遵循藥用植物的生長規律。《中華人民共和國藥典》2010版對丹參采收期的規定為“春、秋二季采挖”[6]。山東、河南、陜西、河北等丹參產區多于霜降前后(10～11月)采挖，少數于次年春季萌芽前采挖。林蔚蘭等[2]調查發現秋季采挖的丹參藥材質量最好，而春季采挖的丹參根色暗淡，質地松泡，質量下降。也有文獻[7]記載，丹參(野生)于農歷3～4月或8～9月采根，以春季采的為好。

本研究結果表明，丹參在11月中旬，即傳統采收期至翌年萌芽前，根部干物質仍有較大積累。丹參植株耐寒，初次霜凍后莖葉仍能保持綠色，并未完全干枯，因此推測，春季萌芽前丹參根干物質的積累增加可能是由于地上部分養分回流至根部所致，這與《名醫別錄》中記載的“至秋枝葉干枯，津潤歸流于下”的說法相似，但這一推斷還需要進一步試驗研究證實。中藥材的采收要兼顧產量和質量綜合考慮，而藥材質量多以內在活性成分的量進行評價。本研究結果表明丹參中4種活性成分的量多于8～9月份積累最高，之后便開始下降一直持續至11月中旬，第2年丹參萌芽過程中，4種活性成分的量又開始不斷增加。據此，初步認為丹參適宜的采收時間應為春季萌芽前。

4.3 丹參中活性成分量的比例關系及其意義還有待進一步研究

藥材中各活性成分的比例關系反應了它們在藥材中的相對量。作為中藥藥效物質基礎，活性成分的量并非越高越好，其在藥材中的相對量可能對其發揮藥效起著重要作用。本實驗對丹參整個生育期內丹酚酸B與隱丹參酮、丹酚酸B與丹參酮ⅡA量的比值進行了分析，發現兩個比值的變化規律極為相似，基本呈現“L”形變化趨勢，在丹參移栽成活初期兩個比值的數值很大，隨后便迅速降低，并很快進入平穩階段，比值固定，一直持續到第2年展葉期仍未改變。山東產區種植丹參采用育苗移栽的方法，丹參苗在移栽過程中其根系受到一定程度的機械損傷，挖出的種苗不能及時栽種便逐漸失水萎蔫，受到一定的干旱脅迫，因此，筆者推測丹參移栽成活初期丹酚酸B與隱丹參酮和丹參酮ⅡA量的較高比值可能與上述機械損傷或干旱脅迫有關，這些外界因素可能促使丹參種苗中丹酚酸B量較大幅度升高，當然，該推測的合理性還有待于結合嚴密的試驗設計進一步深入研究。

[1] 肖禾，宋民憲.中成藥中丹參入藥情況的統計分析[J].華西藥學雜志，2005，20(3)：279-280.

[2] 林蔚蘭，鄧喬華，盧綿，等.三個丹參主產區生產情況調查[J].中藥材，2008，31(3)：340.

[3] 楊繼祥.藥用植物栽培學[M].北京：中國農業出版社，1993.2.

[4] 劉紅云.丹參生長模擬模型及活性成分積累的調控研究[D].西北農林科技大學，2011.

[5] 段金廒，嚴輝，宿樹蘭，等.藥材適宜采收期綜合評價模式的建立與實踐[J].中草藥，2010，(11)：1755-1760.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：70.

[7] 山東衛生干部進修學院.山東中藥[M].濟南：山東人民出版社，1959.

DynamicStudyonBiomassandBioactiveIngredientsAccumulationofRootsofSalviamiltiorrhizaeinDifferentGrowthPeriods

ZHAOZhigang1，GAOShurui1，XIEJing1，YANBinbin1，HOUJunling1*，WANGWenquan1，2，3*，SONGYan4，ZHANGXianming5，LIJun5

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China； 2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 3.EngineeringResearchCenterofGoodAgriculturalPracticeforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China； 4.ShanghaiHuaYuChineseherbsCo.，Ltd，Shanghai200002，China5.LinyishiLongKangChineseHerbsCo.，Ltd.Linyi273300，China)

The paper is aimed to study the biomass accumulation and the content changes of four bioactive ingredients in the roots ofSalviamiltiorrhizaein different growth periods，as to provide theoretical basis for the standardized cultivation ofS.miltiorrhizae.After survival of transplantedS.miltiorrhizae，the biomass accumulation and the content of four bioactive ingredients rosmarinic acid，salvianolic acid B，crytotanshinone and tanshinoneⅡAby dynamic sampling in different growth periods and phonological phases were determined.At the same time，the total content of the four bioactive ingredients and the ratio of salvianolic acid B and crytotanshinone，tanshinoneⅡAin different growth periods were discussed.During the whole growth period，the biomass accumulation ofS.miltiorrhizaeroot showed a “slow-fast-slow-fast” changing trend，dry discount rate showed “M” shape change.The same category active ingredients have withered and yellow phase which is the traditional harvest time，the content of four active ingredients all decreased to some extent.The ratio of salvianolic acid B and tanshinoneⅡAstabilized in early August，and continued until reviving period next year.The total contents of the four bioactive ingredients in the whole growth period showed a similar trend，in the withering period decreasing gradually and increasing during the following year reviving period.It is concluded that the accumulation regular patterns of biomass and four kinds of active ingredients in the root ofS.miltiorrhizaehave been clarified.Comprehensively considering medicinal material production and content of active ingredients，the harvest time ofS.miltiorrhizaeshould be in the spring before bud.

Danshen；biomass；bioactive ingredients；growth periods；harvest time

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.014

2015-01-25)

中藥材規范化生產技術服務平臺[工信部消費(2011)340]；2011年國家工業與信息化部中藥材生產扶持項目

*

侯俊玲，教授，研究方向：中藥材質量評價及其產品開發；Tel：(010)84738334，E-mail：mshjl@126.com； 王文全，教授，研究方向：中藥材質量評價；Tel：(010)84738623，E-mail：wwq57@126.com