北京地區野生柴胡種質資源的ISSR研究△

趙香妍，劉長利，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫科大學 中醫藥學院，中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

·專題·

北京地區野生柴胡種質資源的ISSR研究△

趙香妍，劉長利*，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫科大學 中醫藥學院，中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

目的：通過ISSR分子標記技術考察北京地區野生柴胡不同種質資源之間的親緣關系。方法：從43條引物中篩選出8條合適的引物，對北京地區不同產地采集的15份野生柴胡種質資源進行ISSR分析，構建聚類系統樹狀圖。結果：8條引物共擴增出130條條帶，其中多態性條帶114條，占87.7%，聚類分析顯示北京地區野生柴胡遺傳多樣性較高，并存在明顯的種內遺傳變異。結論：北京地區野生柴胡呈現一定的地域性分布趨勢，應加以保護，初步認為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為北京地區柴胡種質親緣關系研究及栽培品種的選育奠定了基礎。

柴胡；ISSR；北京地區；種質資源；親緣關系

柴胡(Bupleuri Radix)是被中國藥典所收錄的傳統常用大宗中藥材之一，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效。藥典規定柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]。但柴胡屬作為傘形科最大的屬，其品種繁多，文獻記載表明[2-4]市場流通的商品柴胡竟達12種之多，依次為北柴胡、狹葉柴胡、膜緣柴胡、錐葉柴胡、小葉黑柴胡、黑柴胡、霧靈柴胡、銀州柴胡、秦嶺柴胡、興安柴胡等，可見各地藥用柴胡的品種非常混亂，且野生柴胡資源正在減少，市場需求又在不斷擴大，因此，迫切需要開展野生道地柴胡的種質研究及良種選育工作，運用分子技術研究種質之間的遺傳多樣性及親緣關系，有助于優良種質的篩選及培育。

ISSR(簡單序列重復區間擴增多態性，Inter Simple Sequence Repeat)具有快速、高效、高遺傳多樣性、高重復性、高穩定性等特點，其結合了RAPD(隨機擴增多態性DNA標記，Random Amplified Polymorphic DNA)及SSR(微衛星標記，Simple Sequence Repeat)分子標記的優點，是近些年分子生物學的研究熱點。Zhang L等[5]就利用ISSR分子標記技術對87個油桐樹樣本進行了遺傳關系研究，結果顯示樣本呈明顯的地理分化。Medhi K等[6]應用RAPD及ISSR兩種分子標記技術研究了三種花椒屬植物的遺傳多樣性，發現ISSR具有較高的多態性條帶比例及較多的擴增條帶數。Zhan Q Q等[7]利用ISSR和SSR分子標記構建北柴胡遺傳圖譜，構建了包含13個連鎖群、80個位點的首張北柴胡遺傳圖譜，為北柴胡性狀基因定位及優種選育奠定了基礎。

目前，湖北保康、陜西、山西等地柴胡種質ISSR親緣關系研究均有報道，但迄今未見北京地區柴胡種質資源ISSR研究的報道，且歷史上北京地區燕山、太行山一帶是道地藥材“北柴胡”的主要產區之一，經本草考據和產地調查，其原植物來源、外觀性狀和內在質量均優于其它[8]，因此，北京地區柴胡優良種質篩選與研究顯得尤為重要。實驗以北京產道地柴胡為材料，通過ISSR分子標記技術對比考察柴胡種內及種間的親緣關系，為北京地區柴胡優良種質篩選及種苗繁育奠定理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Veriti PCR儀(美國ABI)，DYY-6D電泳系統(北京市六一儀器廠)，離心機(美國，scilogex)，紫外凝膠成像分析儀(法國，VILBER LOURMAT)，MM400混合型球磨儀(德國，Retsch)，微量移液器(德國，BRAND)。

1.2 試劑

DNA提取所用試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶(Takara)，100 bp DNA Ladder(NEB)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實驗材料

實驗所用柴胡樣品共計15份(表1)，所有樣品均于2014年6～9月采收于北京房山、延慶、門頭溝等京郊山區。樣品由北京中醫藥大學劉春生教授和首都醫科大學劉長利副教授鑒定。各產地樣品分別取其幼嫩無蟲害的葉片，-80 ℃保存備用。

表1 實驗材料及來源

2 試驗方法

2.1 基因組DNA提取

取植物新鮮葉片約30 mg，液氮研磨成粉末，利用植物基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA。提取的DNA于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測10 min，以2000 bp DNA Marker 為分子標記，在凝膠掃描儀下觀察并拍照。

2.2 ISSR-PCR

實驗中ISSR-PCR 反應體系為：25 μL反應體系：含有10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.5 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)3.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，引物(10 pmol·μL-1)1.5 μL，DNA模板2.0 μL。擴增程序為：預變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃(因引物不同而異[9])45 s，72 ℃ 2 min，45個循環；最后72 ℃延伸7 min。以ddH2O為陰性對照。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(電壓83 V，120 min)在凝膠掃描儀下觀察并拍照(見圖1)。

2.3 數據分析

對產生了多態性擴增的電泳結果統計各樣品的電泳條帶，按相同遷移位置上有擴增條帶(不論強弱)計為1，無帶計為 0，得到全部樣品的ISSR圖譜的0/1數據矩陣，用NTSYS2.10軟件計算個體間的相似系數，進行UPGMA聚類分析，構建聚類系統樹狀圖。

M為100 bp DNA ladder，1～15為材料編號同表1，0為陰性對照圖1 引物808 ISSR擴增結果

3 結果

3.1 引物篩選

利用4個樣本對43條加拿大British Columbia大學提供的ISSR引物進行篩選，共初步篩選出15條可擴增出3條以上電泳條帶的引物作為實驗有效引物，再利用全部樣本進行復篩，最終，確定8條有效引物(見表2)。

表2 有效引物及其擴增結果

3.2 野生柴胡ISSR遺傳多樣性

從初篩的15條引物中篩選出8條多態性好、條帶清晰的引物，用于15個實驗樣本的PCR擴增，大部分擴增片段大小在100～1500 bp。表2表明，8條引物共擴增出130條條帶，其中多態性位點114個，每個引物擴增位點為14～20個，平均16.25個，其中多態性位點8～18個，平均14.25個，多態性比率為87.7%。這說明供試樣本存在較大的遺傳變異。

3.3 遺傳相似系數

遺傳相似系數是評價物種及居群間親緣關系的重要指標，其值越大，說明親緣關系越近，反之，則越小。15份北京野生柴胡的樣本之間相似系數在0.571～0.813之間(見表3)，其中，來自房山區將軍坨的4號北柴胡樣本與延慶松山自然保護區的10號北柴胡樣本親緣關系最近，相似系數為0.813。而北京市房山區百草畔山頂草甸的3號霧靈柴胡樣品則與房山區蒲洼鄉富合村的5號北柴胡樣本親緣關系最遠，遺傳相似系數為0.571。說明同一物種生活在相近環境中，親緣關系較近，不同物種生活在不同生態環境中，親緣關系較遠。且15份樣本均采自北京各郊區，地理位置較近，所以樣本親緣關系大都較近，而由于品種、生活環境或基因交流等原因致使一些樣本親緣關系較遠。

表3 ISSR標記15份樣本之間的相似系數和遺傳距離

注：下三角為相似系數，上三角為遺傳距離。

3.4 北京地區野生柴胡聚類分析

利用ISSR標記數據計算15份野生柴胡間的遺傳相似系數，并采用UPGMA法構建了北京地區野生柴胡的遺傳關系聚類圖(圖2)，顯示實驗樣本可分為兩大組，第一組共14份樣品，包括除5號樣品的所有樣品，并分為二個亞類，第一亞類包括1號來自房山區六合，4號來自房山將軍坨，10號、11號來自延慶松山，12號來自平谷區鎮羅營鎮，6號、8號、7號來自門頭溝區百花山，9號來自海淀區西山森林公園，3號來自房山百草畔。第二亞類包括來自房山區十渡孤山寨的2號樣品，來自平谷區大華山鎮與王辛莊鎮的13、14號樣品，以及來自密云霧靈山的15號樣本。而第二組則只有來自房山區蒲洼鄉富合村的5號樣本。

圖2 15份北京野生柴胡聚類圖

4 討論

葛亞瑩等[10]利用ISSR分子標記技術對41個麗穗鳳梨品種進行遺傳多樣性研究，12條引物共擴增出132個位點，其中多態性位點125個，多態位點百分率達94.70%，表明ISSR標記具有較高的多態性檢測水平。劉君等[11]則對9種狗牙根進行鑒定分析，結果顯示ISSR可有效揭示9種狗牙根的親緣關系并可用于構建指紋圖譜。Feicui Zhao等[12]利用RAPD和ISSR技術研究烏頭屬4種植物的遺傳多樣性，發現兩種方法均適用于烏頭屬植物的分析，但其中ISSR更具有較高的多態性。Jun Liu等[13]則利用ISSR及SRAP(相關序列擴增多態性，Sequence-Related Amplified Polymorphism)兩種方法分析89份香菇植株的遺傳多樣性，結果發現這2種標記都能揭示材料間較高的遺傳多樣性，而且ISSR標記的多態性又高于SRAP標記。研究表明ISSR是一種有效的揭示品種間遺傳多樣性的實驗技術，實驗中利用8條引物，擴增出130條條帶，其中多態性位點114個，每個引物平均擴增位點16.25個，多態性比率為87.7%，表明北京地區柴胡種質資源存在較大的遺傳變異，實驗研究結果為北京地區野生柴胡種質親緣關系研究奠定了基礎。

Xu L等[14]利用ISSR和SP-SRAP(單引物相關序列擴增多態性，Single Primer-Sequence Related Amplification Polymorphism)研究100份黑粉菌的親緣關系，發現生態環境的特異性質在樣品分化過程中起到了重要的作用。Yu J等[15]研究15個居群的長芒草的遺傳多樣性，發現其與地理距離有很大關系，并認為ISSR分子標記技術可有效可靠地評價長芒草的遺傳多樣性。盧萍等[16]則利用ISSR技術研究了6個種群的小花棘豆的遺傳多樣性，聚類結果表明，生態地理條件相近的種群會優先聚集。遺傳聚類結果顯示，部分結果與上述研究結果相似，6號、7號、8號均來源于門頭溝百花山，9號采自海淀區西山森林公園，其生長環境與百花山山腳環境相類似，所以顯示出較近的親緣關系，13、14、15號樣品均來源于北京平谷區、密云區，也具有較高的相似性，表明生態環境相近的聚為一類。

房山百草畔的3號霧靈柴胡樣本與延慶松山的11號北柴胡樣本聚在一起，其原因可能由于柴胡雌雄蕊異熟的特性導致其異交授粉為主的繁殖方式，一定程度上促進了居群間基因交流，進而出現基因漸滲現象，使得柴胡屬植物的鑒定存在困難，以此，采用多種遺傳分子標記方法與傳統性狀鑒定相結合的方法確定植物基源更為可靠。此外，來源于房山區蒲洼鄉富合村的5號樣本則可能是采集地地勢相對較高，且地處偏僻的山區，基因交流相對較少，所以自成一支。

由于經濟利益的驅使，人們對于野生柴胡資源的亂采濫挖現象日益嚴重，從而使得野生柴胡資源遭到嚴重破壞，藥用資源得不到保障。另外，各地藥用柴胡來源的復雜性造成了柴胡質量的不穩定性，以至于臨床療效受到嚴重影響。基于以上問題，開展柴胡藥材的質量研究及人工栽培優良種質篩選尤為重要，而ISSR分子標記技術則能很好的揭示品種間的親緣關系，并為栽培品種的選育奠定基礎。賈金萍等[17]通過對北柴胡樣本的皂苷含量、指紋圖譜及AFLP(擴增片段長度多態性，Amplified Fragment Length Polymorphism)分子標記研究，認為柴胡的化學表型差異與其遺傳差異具有一定的相關性，且AFLP分子標記法可有效區分不同的柴胡種群。而也有學者[18]表示皂苷含量較高且遺傳多樣性豐富的種質資源更具有推廣的價值。實驗結果顯示，皂苷含量較高的西山森林公園的9號樣本(課題組已測定)與門頭溝百花山的7號、8號樣本親緣關系較近(見表3)，初步認為百花山山腳與山腰的柴胡種質遺傳多樣性較好，值得推廣種植。此外，柴胡屬植物由于基因漸滲出現的資源混亂的復雜問題，則可利用ISSR等分子標記技術與標準藥材進行親緣關系研究，并與形態鑒定結合的方式進行鑒定，使得結果更加可靠，進而提高用藥效果。

5 結論

利用ISSR分子標記技術對北京地區野生柴胡的親緣關系研究中，15份樣本擴增出130條條帶，其中多態性位點114個，每個引物平均擴增位點16.25個，相似系數在0.571～0.813之間，表明北京地區野生柴胡具有較高的遺傳多樣性，并同時存在一定的種內遺傳變異。而利用UPGMA聚類分析，則將15份材料進行分類，聚類結果呈現出一定的地域性分布趨勢。綜上，北京地區野生柴胡應加以保護，初步認為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為今后開展北京地區柴胡種質親緣性研究及栽培品種的選育奠定了基礎。

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ISSRResearchonGermplasmofBupleurumchinenseDC.inBeijing

ZHAOXiangyan，LIUChangli*,XUEWenfeng，ZHANGXianan,LUORong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，Beijing100069，China)

Objective：To assess population genetic diversity of different kinds of individuals ofBupleurumchinensein Beijing area by inter simple sequence repeat (ISSR) technique.Methods：Eight appropriate ones were selected from a total of forty-three primers for ISSR PCR amplification to analyse theBupleurumin Beijing area and draw dendrograms by using genetic distance UPGMA method.Results：A total of 130 bands and 114 polymorphic bands were amplified by 8 primers，the polymorphic loci accounted for 87.7%.The cluster analysis showed that genetic diversity was high inBupleurum， the intraspecific genetic variation was obvious.Conclusion：The distribution ofBupleurumgermplasm in Beijing exhibited a certain regional characteristics.It is imperative to strengthen the protection ofBupleurumwild resources.The plants in the foot and hillside of Baihuashan is good for cultivating.This study laid a foundation for the research of relationship betweenBupleurumand the breeding of cultivars.

Bupleurum；ISSR；Beijing area；germplasm；genetic relationship

2015-07-01)

北京市自然科學基金資助項目(6142002)；首都中醫藥研究專項(14ZY04)

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劉長利，副教授，研究方向：中藥材規范化生產及其藥材質量調控研究；Tel：(010)83911633，E-mail：lcl74@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.004