芪精多糖片治療化療骨髓抑制的藥效評價及調控Notch表達的研究△

王立芳，徐振曄，司海龍，王中奇，鄧海濱，蘇婉

(上海中醫藥大學 附屬龍華醫院 腫瘤二科，上海 200032)

·基礎研究·

芪精多糖片治療化療骨髓抑制的藥效評價及調控Notch表達的研究△

王立芳，徐振曄*，司海龍，王中奇，鄧海濱，蘇婉

(上海中醫藥大學 附屬龍華醫院 腫瘤二科，上海 200032)

目的：進一步評價芪精多糖片治療骨髓抑制小鼠的療效，探討其作用機制。方法：采用小鼠腹腔注射環磷酰胺造成化療骨髓抑制模型，用芪精多糖片干預治療，常規計數白細胞、紅細胞、血小板、骨髓有核細胞數，流式細胞儀檢測Sca-1+CD34+細胞以比較骨髓造血干細胞比例，FQ-PCR法檢測Notch1、Notch2 mRNA表達。結果：治療組白細胞、骨髓有核細胞、造血干細胞數、Notch1表達、Notch2表達均高于模型對照組，血小板、紅細胞治療組與模型組未發現差異。結論：芪精多糖片具有良好的升高化療骨髓抑制小鼠白細胞的作用，其作用機理與調控Notch1、Notch2 mRNA表達、促進骨髓造血干細胞增殖有關。

芪精多糖；骨髓抑制；造血干細胞

芪精多糖片來源于上海中醫藥大學附屬龍華醫院徐振曄教授的經驗方藥雙黃升白方，屬于中藥成分組合制劑，目前劑型為片劑，主要用于治療腫瘤化療導致的骨髓抑制(主要表現為白細胞降低)，前期研究已明確該藥具有良好的改善化療骨髓抑制期骨髓造血功能的作用，升高白細胞療效較好，且已確定最佳服用及有效劑量[1-5]。本研究在前期基礎上對其治療化療骨髓抑制的藥理藥效進行了進一步研究。

1 材料

1.1 動物

SPF級近交系昆明小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，合格證號：SCXK(滬)2012-0002，雄性，20 g左右。飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級飼養室，動物房設施許可證號SYXK(滬)2010-0095。

1.2 主要藥物與試劑

芪精多糖片(上海靜安制藥廠，批號：141104-1)；注射用環磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：13052425)；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(bioline公司)；CD34抗體、Sca-1抗體(biolegend公司)；引物探針(上海捷瑞生物工程公司)，Notch1引物序列：Sense：5′actgtgacagccagtgcaac 3′，Antisense：5′gccatcactgaagtggtcct 3′；Notch2引物序列Sense：5′ cagcactgtgacagccctta 3′，Antisense：5′aggtgctcccttcaaaacct 3′。內參GAPDH引物序列Sense：5′aactttggcattgtggaagg3′，Antisense：5′ggatgcagggatgatg-ttct3′。

2 方法

2.1 模型制備及分組

24只昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、治療組，每組8只。正常組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 mL，連續3 d；灌服0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d-1，連續6 d。模型組腹腔注射CTX用法同治療組；灌服0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d-1，連續6 d。治療組腹腔注射CTX 2 mL·d-1，相當于100 mg·kg-1·d-1，連續3 d；灌服芪精多糖溶液(藥物劑量采用前期研究確定最佳服藥劑量[5])0.4 mL·d-1，相當于芪精多糖0.66 g·kg-1·d-1(黃芪多糖0.45 g，黃精多糖0.21 g)，連續6 d。

2.2 觀察指標及方法

各組分別于最后一天用藥后2 h摘眼球采血，頸椎脫臼處死，無菌無RNA酶條件下迅速剝取雙側股骨，以醫用剪刀剪開小鼠股骨兩端，露出骨髓腔，備用。觀測以下指標：(1)血常規：KT6180全自動血細胞分析儀觀察外周血白細胞、紅細胞、血小板的數量；(2)骨髓有核細胞數：取左側股骨，以1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)液反復沖洗，直至骨髓腔發白，將洗脫的骨髓細胞置于1.5 mL離心管，取0.1 mL用細胞計數板計數，顯微鏡下計數有細胞核的細胞數量(不包括無細胞核的成熟紅細胞)，計數所得的10倍即為單側股骨總有核細胞數。(3)骨髓造血干細胞數：左側骨髓迅速進行有核細胞計數后，加入紅細胞裂解液，去除紅細胞，PBS洗后重新懸浮，以Sca-1+CD34+為標記檢測小鼠骨髓造血干細胞，吸取100 μL細胞懸液(細胞濃度≥1×106個· mL-1)，分別加入10 μL PE標記的大鼠抗小鼠Sca-1抗體和FITC標記的大鼠抗小鼠CD34抗體，同時以不加抗體的細胞懸液作陰性對照，室溫避光孵育20 min，重新懸浮，上流式細胞儀檢測。(4)Notch1、Notch2 mRNA表達：無菌無RNA條件下迅速取右側股骨，PBS反復沖洗出骨髓，收集骨髓細胞，常規進行總mRNA的抽提，FQ-PCR法檢測Notch1與Notch2 mRNA表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，內參及Notch1、Notch2溶解曲線見圖1-3。

圖1 GAPDH熔解曲線

圖2 Notch 1溶解曲線

圖3 Notch 2溶解曲線

詳細方法如下：將骨髓細胞置于研磨器(1.5 mL EP管)中，加入1 mL預冷的Trizol研磨，常規進行mRNA抽提；cDNA第一鏈合成(反應條件：45 ℃ 30 min逆轉錄；85 ℃，5 min，滅活MMLV)，-20 ℃冰箱，保存，待用；real-timePCR檢測，PCR擴增檢測條件見表1。

表1 PCR擴增檢測條件

數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7500 SDS Software分析。mRNA相對表達量=2-Δct×100%，Δct=目標基因CT值-內參(GAPDH)CT值。

2.3 統計方法

采用SPSS20.0進行統計，進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，以P<0.05為有統計學差異。

3 結果

3.1 血常規分析

模型組應用CTX造模后白細胞較正常組明顯下降，而治療組雖然較正常組白細胞降低，但高于模型組(P<0.05)，因此可以推論芪精多糖片具有升高骨髓抑制小鼠白細胞的作用。模型組血小板較正常組降低(P<0.05)，但與治療組比較無統計學差異，有待今后增大樣本量進一步觀察。模型組紅細胞較正常組與治療組低，但無統計學差異，考慮與紅細胞壽命較長、本研究觀察期較短有關，有待今后延長觀察期以進一步明確芪精多糖片是否對骨髓紅系造血功能有促進作用。見表2。

表2 各組白細胞、紅細胞、血小板計數比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，△P<0.05；下同。

3.2 骨髓有核細胞數

骨髓有核細胞數是反應骨髓造血功能的主要指標之一。模型組骨髓有核細胞數明顯低于正常組(P<0.05)，而治療組骨髓有核細胞數未見明顯降低(P>0.05)，考慮應用CTX后骨髓造血功能抑制，骨髓有核細胞數減少，應用芪精多糖片干預后造血功能抑制減輕、恢復加快。見表3。

表3 小鼠骨髓有核細胞數的比較

3.3 造血干細胞數量比較

CD34、Sca-1為小鼠骨髓造血干細胞標志物，模型組及治療組Sca-1+CD34+細胞比例高于正常組(P<0.05)，考慮與第4天停用CTX后骨髓造血功能進入恢復期、造血干細胞增殖加速有關。治療組Sca-1+CD34+細胞比例高于模型組(P<0.05)，結合骨髓有核細胞數量比較，考慮芪精多糖片具有較好的促進骨髓造血干細胞增殖的作用，見圖4-6、表4。

3.4 Notch1與Notch2 mRNA表達

Notch信號能促進造血干細胞增殖，其mRNA表達高低可從一定程度上反映骨髓造血細胞增殖情況。本研究中Notch1 mRNA表達治療組較模型組及正常組均升高(P<0.05)，模型組則較治療組降低(P<0.05)，Notch2表達模型組與正常組無差異(P>0.05)，治療組較模型組及正常組均明顯升高(P<0.05)。考慮芪精多糖片具有促進化療骨髓抑制小鼠骨髓中Notch1、Notch2 mRNA表達的作用。見表5。

圖4 正常組造血干細胞比例圖

圖5 模型組造血干細胞比例圖

圖6 治療組造血干細胞比例圖

表4 小鼠造血干細胞(Sca-1+CD34+細胞)的比較

表5 小鼠骨髓Notch1、Notch2 mRNA相對表達量的比較

4 討論

骨髓抑制是腫瘤化療常見不良反應，主要表現為外周血細胞(尤其是白細胞)降低，目前治療腫瘤化療骨髓抑制主要采用集落刺激因子(CSF)促進骨髓造血干細胞增殖分化。然而，造血干細胞的增殖分化更多地依賴于造血微環境的調控，CSF僅是其中的一方面因素。芪精多糖是來源于上海市名中醫徐振曄教授經驗方藥的中藥組分制劑，具有良好的臨床基礎[2]，前期研究已發現該藥物成分組合對于骨髓造血微環境具有良好的保護和促進作用。

Notch是造血系統發育過程中的一條重要信號通路，與造血干細胞增殖、分化、自我更新密切相關，存在于所有已知動物細胞中，介導細胞間的局部信號傳遞及相應的信號級聯反應，能夠擴大并固化相鄰細胞之間的分子差異，最終決定細胞的命運[6]。抑制Notch信號能加速造血干細胞的分化，降低其造血重建能力[7]。本研究發現治療組Notch1、Notch2 mRNA表達升高，說明芪精多糖能加速這種功能恢復過程，因此我們認為芪精多糖治療骨髓抑制的機制與調控Notch表達有關。

組分中藥是21世紀中藥新藥研究和開發的創新模式，它突破了傳統中藥方劑成分較為繁雜、藥效和藥物質量不穩定等缺陷。在傳統祖國醫學理論指導下，將所提取中藥有效組分進行配伍和組方，所制成的復方制劑，既具有現代藥理學的現代性，且又兼備中藥復方配伍聯合應用的傳統特點，可闡明多個有效組分之間的相互作用的性質(增效、拮抗、相加)[8]。與傳統中藥方劑相比，組分中藥具有“安全、有效、穩定、可控”的藥物特征，還具有復方、配伍、多途徑、多靶點、多效應整合調控作用模式等中醫藥特點[9]。芪精多糖目前已制成片劑，制劑工藝簡捷，藥品質量穩定，口感良好，本研究對其治療化療骨髓抑制的療效進行了進一步評價，從調控Notch信號角度對其機制進行了探討，為其向臨床新藥轉化提供了理論基礎，但該藥對紅細胞及血小板的影響尚待進一步研究，今后進一步闡述其作用機制有利于促進該制劑申報新藥，為臨床治療腫瘤化療骨髓抑制提供新的選擇。

[1] 吳秋霞.黃芪黃精藥對主要組分配伍配比對骨髓抑制小鼠造血系統保護作用的研究[D].上海：上海中醫藥大學，2011.

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[3] Xian Gu，Zhenye Xu，LingYu Zhu，et al.Dual control of Shuanghuang Shengbai Granule on CyclinD-CDK4/6 signal pathway of cell reproductive cycles in Lewis-bearing mice with cyclophosphamide-induced myelosuppression[J].Onco Targets and Therapy，2013，6：199-209.

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[8] 葉祖光.中藥復方與組分中藥[J].中國新藥雜志，2011，20(16)：1487-1489.

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EfficacyEvaluationofQiJingPolysaccharideTabletsinTreatmentofBoneMarrowInhibitionCausedbyChemotherapyandResearchinRegulationofNotchExpression

WANGLifang，XUZhenye*，SIHailong，WANGZhongqi，DENGHaibin，SUWan

(TraditionalChineseMedicineTumorResearchInstituteofShanghaiUniverstityofTCM，Shanghai200032，China)

Objective：To further evaluate the treatment efficacy of Qi Jing polysaccharide tablets on mice with bone marrow suppression and explore the mechanism.Methods：The mice bone marrow suppression model caused by intraperitoneal injection of cyclophosphamide were used in the study，Qi Jing polysaccharide tablets were given for the intervention treatment.The conventional counting white blood cells，red blood cells，platelet count，bone marrow nucleated cells were measured，the Sca-1+CD34+ positive cells of bone marrow were detected by using flow cytometry to compare the stem cells number.The Notch1 and Notch2 mRNA expression were detected by FQ-PCR method.Results：The Notch1，Notch2 mRNA expression in white blood cells，bone marrow cells and hematopoietic stem cell number in the bone marrow in the treatment group were higher than those in the control group.There was no difference between treatment group and the untreated group in platelets and red blood cells counting.Conclusion：Qi Jing polysaccharide tablets have good effect on increasing white blood cells of mice with chemotherapy caused myelosuppression，the mechanism is related to regulation of Notch1，Notch2 mRNA expression and promotion of bone marrow stem cell proliferation.

Qi Jing polysaccharide tablets；myelosuppression；hematopoietic stem cell

2015-06-03)

國家自然科學青年基金資助項目(81202670)；上海市科委自然科學基金資助項目(12ZR1431800)；上海市衛生局資助項目(2011XY006)

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徐振曄，主任醫師，研究方向：中醫藥治療惡性腫瘤及相關疾病；E-mail：xuzhenye1947@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.010