ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物△

明孟碟，張超，嚴緒華，劉美霞，夏葉，楊紅兵*，胡志剛*

(湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫醫院，湖北 武漢 430010)

·專題·

ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物△

明孟碟1，張超1，嚴緒華2，劉美霞1，夏葉1，楊紅兵1*，胡志剛1*

(湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫醫院，湖北 武漢 430010)

目的：基于ITS2序列鑒定十大功勞屬藥用植物，以避免該屬物種藥用基原混亂。方法：收集十大功勞屬物種作為實驗材料，采用改良的CTAB法提取總DNA，經PCR擴增、雙向測序和序列拼接，應用MEGA 6.0對該屬13個物種43條ITS2序列進行序列變異分析，計算種內種間Kimura 2-parameter(K2P)距離，構建系統鄰接(NJ)樹。結果：十大功勞屬13個物種43條ITS2序列分析結果表明，各物種種內最大(平均)K2P距離均不大于種間最小(平均)K2P距離；系統NJ樹結果顯示，十大功勞屬其中9個物種各自聚為一支。結論：ITS2序列對十大功勞屬藥用植物具有較好鑒定效果，為該屬藥用植物的臨床用藥安全提供了分子依據。

十大功勞屬；ITS2序列；藥用植物；分子鑒定

小檗科Berberidaceae 十大功勞屬Mahonia植物是一類常見的藥用、觀賞兩用的植物[1]，在我國分布有31種[2]，其中藥用22種[3]，主要以根、莖入藥。《中華人民共和國藥典》(2015年版)將該屬物種闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr.和細葉十大功勞M.fortunei(Lindl.) Fedde.的干燥莖作為“功勞木”藥材的來源，功勞木含有生物堿、揮發油及總黃酮等多種有效成分[4-5]，具有清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰益肺、兼補肝腎的功效[6]。由于該屬物種形態上極為相似，市場上存在用長柱十大功勞M.duclouxianaGagnep.和小果十大功勞M.bodinieriGagnep.等充當“功勞木”藥材使用的情況[7-8]，給用藥安全帶來隱患。運用傳統的鑒定方法區分該屬物種存在一定的局限性[9-11]。如何快速、準確地區分十大功勞屬藥用植物，對該屬藥用物種的資源開發和臨床應用具有重要意義。

隨著分子生物技術的快速發展，利用遺傳物質DNA鑒定物種逐漸成為國際分子鑒定的研究熱點。DNA條形碼是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA片段來實現物種鑒定的一種分子生物學技術，是近年來生物分類學的研究熱點[12]。該方法具有快速、準確、不受樣品的形態性狀限制等優點，適用于藥材和基原物種的鑒定，是傳統中藥鑒定方法的有效補充。陳士林等[13-17]在研究了6115個物種30 886個樣品的基礎上，提出了以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系，推動中藥鑒定學邁入規范化、標準化基因鑒定時代。有關學者利用ITS2序列鑒定葶藶子[18]、羌活[19]、赤芍[20]、金沸草[21]、紅景天[22]以及谷物芽類[23]等藥材，均取得了較好的鑒定結果。本研究運用ITS2序列對十大功勞屬藥用植物進行分子鑒定，為十大功勞屬藥用植物的區分提供分子依據。

1 材料

本研究收集十大功勞屬8個物種32份實驗材料，經湖北中醫藥大學生藥教研室張秀橋教授鑒定，另從GenBank下載11條序列，經查閱文獻證實其基原準確可靠[24-26]。植物材料來源及GenBank下載序列信息詳見表1。

表1 十大功勞屬實驗材料及GenBank下載序列信息

2 方法

2.1 DNA提取

取樣品的干燥葉片30 mg，用球磨儀(Retsch MM400)以30 Hz/s研磨2 min，利用改良的CTAB法[27]提取總DNA。

2.2 PCR擴增及測序

ITS2序列：正向引物 ITS2-2F(5′-ATGCGATAC-TTGGTGTGAAT-3′)，反向引物ITS2-3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)；反應體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，總DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL；擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(進行40個循環)；72 ℃延伸10 min[28]。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物情況，用ABI 3730XL測序儀(Applied Biosystems Co.，USA)對條帶單一且清晰的PCR產物進行雙向測序。

2.3 數據處理

所得序列使用CondonCode Aligner V 4.2.4(CondonCode Co.，USA)軟件進行質量分析和拼接；使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法去除兩端5.8S和28S區段，獲得ITS2間隔區序列[29]。所有序列用MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)6.0 進行序列比對分析[30]，基于K2P(Kimura2-Parameter)雙參數模型計算種內種間遺傳距離，采用鄰接(Neighbor Joining，NJ)法構建系統聚類樹。

3 結果與分析

3.1 十大功勞屬藥用植物序列變異分析

十大功勞屬13個物種43條序列比對后長度為224 bp，共產生28個變異位點；細梗十大功勞與寬苞十大功勞、細葉十大功勞與北江十大功勞之間未出現種間變異，其它物種均存在種間變異位點。

3.2 十大功勞屬藥用植物遺傳距離分析

運用K2P模型對十大功勞屬物種ITS2序列進行遺傳距離分析，結果見表2。結果表明，細葉十大功勞與北江十大功勞、寬苞十大功勞與細梗十大功勞兩組序列無變異位點，故其種內最大K2P距離均等于種間最小K2P距離，其它各物種的種內最大(平均)K2P距離均小于其與其它物種種間最小(平均)K2P距離。

表2 十大功勞屬各物種種內及與其它物種種間K2P距離

3.3 十大功勞屬藥用植物系統NJ 樹鑒定

基于ITS2序列，應用鄰接(NJ)法構建十大功勞屬藥用植物的系統聚類樹，見圖1。從系統NJ樹看出，細葉十大功勞與北江十大功勞聚為一支，寬苞十大功勞與細梗十大功勞聚為一支；除此以外，該屬其它物種各自聚為一支，各物種間能明顯區分開。

注：bootstrap 1000次重復，僅顯示支持率≥50%的分支圖1 基于ITS2 序列構建的十大功勞屬藥用植物鄰接(NJ)樹

4 討論

根據文獻記載[3]，我國十大功勞屬植物中具有藥用價值的有22種，它們無論在植物形態還是藥材形狀方面都具有一定的相似性，易造成混用。采用DNA條形碼這種快速、有效、準確的鑒定方法對我國十大功勞屬藥用植物進行鑒定，可有效解決物種基原混亂等問題，為合理開發利用我國十大功勞屬植物資源提供理論依據。

基于MEGA 6.0軟件的序列變異分析結果顯示，細葉十大功勞與北江十大功勞間未產生變異位點，寬苞十大功勞與細梗十大功勞間未產生變異位點，因此基于變異位點無法區分這兩組物種；這一結果在兩組物種間的K2P距離和NJ 樹分析結果中也得到了驗證。目前十大功勞屬藥用植物的鑒定研究不多，運用DNA分子鑒定技術對該屬藥用植物鑒定，針對無法區分的細葉十大功勞與北江十大功勞、寬苞十大功勞與細梗十大功勞兩組物種，可考慮篩選其它序列或復合序列進行分子鑒定。除這兩組物種外，該屬其它各物種種間均存在變異位點；各物種種內最大(平均)K2P距離均小于其與其它物種種間最小(平均)K2P距離；系統NJ 樹結果表明，各物種均各自聚為一支，相互之間能很好地區分開。以上實驗結果均表明，ITS2序列可以較好地鑒定十大功勞屬藥用植物。

十大功勞屬藥用植物種類繁多，形態相似，給藥材的識別和流通帶來了困難。為更便捷地實現對該屬藥用植物的鑒定，可將中藥材二維DNA 條形碼技術運用于藥材的鑒定中來。中藥材二維DNA條形碼[31]是指基于開源代碼QR Code(quick response code) 將DNA條形碼技術與二維碼技術相結合，以達到快速、穩定、便捷地鑒定中藥材的目的。為此，可在本研究的基礎上，將各物種的ITS2序列轉換為二維碼，通過掃描識讀，以實現對該屬藥用植物的快速、準確識別。

綜上，該研究所采用的各種分析方法都表明，ITS2序列可用于鑒定十大功勞屬藥用植物，為該屬藥用植物的區分和臨床用藥安全提供了分子依據。

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IdentificationofGenusMahoniaMedicinalPlantsBasedonITS2Sequence

MINGMengdie1，ZHANGChao1，YANXuhua2，LIUMeixia1，XIAYe1，YANGHongbing1*，HUZhigang1*

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430010，China)

Objective：To Identify the genusMahoniamedicinal plants，based on ITS2 sequences.Methods：Total genomic DNA was extracted from experimental materials by the improved CTAB method.The ITS2 sequences were obtained after PCR amplification，bidirectional sequencing and sequence assembly.The genetic distances based on the Kimura 2-parameter(K2P)model，variable sites and neighbor-joining(NJ)phylogenetic tree were computed by MEGA 6.0.Results：Based on ITS2 sequences，the study indicated that the intraspecific maximum and average genetic distances were no greater than the interspecific ones.In all of the 13 samples，9 of them were respectively clustered into a single branch in the NJ phylogenetic tree.Conclusion：ITS2 sequence has a good effect on the identification of the genusMahoniamedicinal plants，which can provide basis to ensure the safety of medicines of the genusMahoniamedicinal plants.

Mahonia；ITS2 sequence；medicinal plants；molecular identification

2015-08-08)

重大新藥創制國家重大科技專項子課題(2014ZX09304307001-021)；湖北省科技支撐計劃項目(2015BCA275)

*

楊紅兵，教授，研究方向：中藥品種、質量與資源研究；Tel：027-68890106，E-mail：yanghb321@126.com；胡志剛，副教授，研究方向：中藥資源與分子鑒定；Tel：027-68890106，E-mail：zghu0608@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.001