基于HPLC/ESI-MS技術的川烏加熱前后化學成分變化△

林宏英，蘇暢，段天璇，黃建梅，孫毅坤，王玥，冀嬌嬌，董潔，劉永剛*

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京鑫康辰醫(yī)學科技發(fā)展有限公司，北京 100048)

·基礎研究·

基于HPLC/ESI-MS技術的川烏加熱前后化學成分變化△

林宏英1，蘇暢2，段天璇1，黃建梅1，孫毅坤1，王玥1，冀嬌嬌1，董潔1，劉永剛1*

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；2.北京鑫康辰醫(yī)學科技發(fā)展有限公司，北京 100048)

目的：研究川烏在加熱前后生物堿變化。方法：采用LC-MS測定方法，Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；流動相為醋酸銨(氨水調pH 8)-乙腈(20 mmol·L-1)；流速為1.0 mL·min-1；質譜采用正離子檢測模式。結果：分析鑒定了川烏中13個生物堿類成分，其中9個生物堿在加熱過程中的變化較明顯。結論：本方法簡便，具有較高的準確度和精密度，可用于生物堿變化的分析。

川烏；液質聯(lián)用；成分變化

川烏為常用中藥，是毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，主產于四川江油、平武、綿陽，陜西城固、戶縣、南鄭等地。具有回陽救逆、溫中補腎、散寒止痛等功能，用于風寒濕痹，關節(jié)及筋骨疼痛，頭風疼痛，半身不遂，寒疝腹痛，陰疽腫毒等證[1]。從漢代張仲景的《金匱要略》出現烏頭的炮制方法起，演變至今已有約70多種炮制方法，主要有鹽炙川烏、酒炙川烏和川烏炭等。一直以來，對川烏的炮制研究主要集中在烏頭堿等3種雙酯型生物堿的變化上[2-6]，由于方法的限制，所得到的信息不夠全面，具有一定的局限性。本試驗采用HPLC/ESI-MS技術對川烏加熱不同時間的化學成分進行了全面的研究，闡明了川烏經炮制后化學成分的量變和質變。該方法靈敏度高，結果準確可靠，為中藥材的炮制研究提供了新思路和新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI-MS，美國Thermo Fisher公司)；電子天平(BSA124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；pH計(PHS-W系列，上海般特儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ32OO型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、苯甲酰烏頭堿對照品、苯甲酰新烏頭堿對照品、苯甲酰次烏頭堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110720-201111，110798-201106，110799-201106，111794-201102，111795-201002，111796-201002)；乙腈(色譜純，美國MREDA TECHNOLOGY INC)；醋酸銨(分析純，Sigma-Aldrich公司)；氨水(分析純，北化精細化工有限公司)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團公司)；川烏藥材(四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿6種對照品適量，加甲醇溶解，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取生川烏藥材粉碎，精密稱取10 g，2份，分別置于500 mL的燒瓶中，各加水500 mL。其中1份加熱回流提取，保持微沸，分別于10、30、60、90、120、150、180 min取樣，每次取1 mL，再加1 mL水補足減失的重量。色譜圖見圖1。

A.加熱10 min；B.加熱30 min；C.加熱60 min；D.加熱90 min；E.加熱120 min；F.加熱150 min；G.加熱180 min。圖1 加熱不同時間的總離子流色譜圖

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸銨(pH=8)，梯度洗脫：0～40 min，15%～30%乙腈，40～70 min，30%～60%乙腈；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1。

2.3.2 質譜條件 正離子檢測模式。噴霧電壓(Spray Voltage)為3000 V；離子傳輸管溫度為350 ℃；蒸發(fā)器溫度(Vaporizer Temperature)為250 ℃；鞘氣壓力(Sheath Gas Pressure)為30 arb；輔助氣壓力(Aux Gas Pressure)為10 arb；采用全掃描(Full Scan)、二級全掃描(MS2)，全掃描質量范圍(m/z)為100～1200；MS2碰撞氣為氬氣；分流進樣，分流比為4∶1。

3 結果

3.1 生物堿的鑒定

準分子[M+H]+烏頭類生物堿在陽離子模式下很容易檢測到[7]，這在本試驗中也得到了進一步的證實。通過對LC-MS檢測結果的分析，在川烏加熱提取中除了雙酯型生物堿外，還檢測到多種化合物，其準分子離子m/z分別為486、500、470、590、604、572、574、586和556，結合其MS2譜特征離子，推測其對應的化合物分別為中烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、焦中烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、焦烏頭堿、焦烏頭次堿，其中中烏頭原堿、烏頭原堿、次

烏頭原堿、中烏頭次堿、烏頭次堿和次烏頭次堿6個化合物分別為中烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿水解產物。相應的碎片離子見表1。另外，結合參考文獻[7]，又鑒定了4個生物堿，分別為去氧次烏頭原堿、塔拉胺、Karakolidine和尼奧靈。結合文獻[8]報導，推斷焦烏頭堿、焦烏頭次堿和焦中烏頭堿為熱解產物。

表1 13個化合物的MS2裂解特征

3.2 9個生物堿的含量變化

通過分析不同加熱時間不同產物的峰面積，加熱時間分別為10、30、60、90、120、150、180 min。9個化合物峰面積發(fā)生了明顯改變，其變化曲線見圖2。

圖2 9個化合物峰面積變化的加熱曲線圖

4 討論

在化合物液相分離過程中，流動相選擇對試驗起著關鍵性的作用。本試驗使用的流動相為乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸銨，醋酸銨用氨水調pH至8.0～8.4。流動相PH值對結果影響較大，試驗過程中應注意控制PH值。

本試驗采用先進的HPLC/ESI-MS技術對川烏加熱前后的化學成分進行了全面系統(tǒng)的研究，發(fā)現川烏經炮制后不但有已知成分量的變化，而且還有內在成分質的改變。這些炮制后新產生的組分以及發(fā)生量變的組分極有可能是川烏炮制后功能改變的物質基礎，但是僅靠質譜分析并不能確定這些未知物質的準確結構，需要借助其他手段做進一步研究。

川烏炮制后化學成分質量分數有的增加，有的減少，很可能是某些成分在炮制過程中發(fā)生了化學反應，轉化成了其他的成分。在試驗過程中筆者發(fā)現，隨著炮制時間延長，烏頭堿等雙酯堿質量分數逐漸減少，而單酯型生物堿質量分數逐漸增加，到一定時間后逐漸減少，焦烏頭堿也呈現此規(guī)律。因此，推測烏頭堿在加熱過程中發(fā)生了兩種反應，一種是水解過程，由于酯水解過程需要水的參與；而生成焦烏頭堿的過程中不需要水的參與，故推測為熱解反應。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：36-37.

[2] 王勇，劉淑瑩.烏頭堿類生物堿的質譜研究進展[J].質譜學報，2002，23(2)：112-119.

[3] 李正邦，呂光華，陳東林，等.草烏中生物堿的化學研究[J].天然產物研究與開發(fā)，1997，9(1)：91.

[4] 符華林.我國烏頭屬藥用植物的研究概況[J].中藥材，2004，27(2)：149-152.

[5] 高黎明，鄭尚珍，沈序維，等.烏頭屬植物中二萜生物堿研究進展[J].西北師范大學學報，1999，35(2)：109-116.

[6] 王本祥.現代中藥藥理學[M].天津：天津科學技術出版社，1997.

[7] Hu R，Zhao J，Qi L W，et al.Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23(11)：1619-1635.

[8] 王峰峰，宋兆輝，張?zhí)m蘭，等.烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解和醇解產物的研究[J].中國中藥雜志，2012，37(11)：1564-1569.

中國植物學會第十三屆全國藥用植物及植物藥學術研討會

暨2015年海峽兩岸中醫(yī)藥科學交流會

第一輪通知

為了進一步促進我國藥用植物研究的深入，推動中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中國植物學會第十三屆全國藥用植物及植物藥學術研討會暨2015年海峽兩岸中醫(yī)藥科學交流會擬于2015年7月中旬在世界文化與自然雙重遺產、世界生物圈保護區(qū)，國家級自然保護區(qū)武夷山舉行。本次會議由中國植物學會藥用植物及植物藥專業(yè)委員會主辦，福建農林大學生命科學學院承辦，福建生物工程職業(yè)技術學院，三明市農科院藥用植物研究所等單位協(xié)辦。會議主題“藥用植物與中藥現代化”。大會將邀請國內相關領域院士和知名專家學者就國內外藥用植物與中藥現代化方面研究的發(fā)展趨勢、最新進展及熱點領域、熱點問題等作學術報告，同時邀請多名臺灣地區(qū)該領域的知名學者作大會報告，促進海峽兩岸的交流與合作。熱誠歡迎全國藥用植物及植物藥同仁踴躍參加本次學術盛會。

詳情瀏覽《中國現代中藥》官方網站(http://www.zgxdzy.net/ch/reader/view_news.aspx?id=20150318090129001)

ChangesofChemicalConstituentsinRadixAconitiPreparatabeforeandafterHeatingBasedonHPLC/ESI-MS

LINHongying1，SUChang2，DUANTianxuan1，HUANGJianmei1，SUNYikun1，WANGYue1，JIJiaojiao1，DONGJie1，LIUYonggang1*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.BeijingXKCMedi&TechDevelopeCo.，Ltd.，Beijing100048，China)

Objective：To analyze the changes of chemical constituents inRadixAconitiPreparata before and after heating.Methods：The different extract ofRadixAconitiPreparata were detected by using HPLC/ESI-MS.Results：The constituents with significant differences before and after heating were identified.The results showed that a total of 13 chemical constituents were identified and nine constituents were significantly different before and after heating.Conclusion：The HPLC/ESI-MS method is proved to have a high sensitivity and the result is accurate and reliable.The method could reflect the changes of multiple chemical constituents of Chinese materia medica in the course of processing.

RadixAconitiPreparata；HPLC/ESI-MS；chemical constituents

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.005

2014-10-01)

北京中醫(yī)藥大學自主選題項目(2013-JYBZZ-JS-039)

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劉永剛，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥物質基礎研究；Email：liuyg0228@163.com