甜瓜翠雪5號的二維碼構建及種子純度分子檢測技術

沈　佳，壽偉松，張躍建

（浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

甜瓜翠雪5號的二維碼構建及種子純度分子檢測技術

沈佳，壽偉松，張躍建*

（浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

為建立雜交甜瓜種子純度快速檢測體系，本研究以甜瓜新品種翠雪5號為例，采用已報道的18對甜瓜基因組高多態性的SSR標記構建翠雪5號親本的指紋圖譜并建立易于識別的數字化二維碼。在篩選獲得兩親本材料多態性SSR標記的基礎上，本研究利用這些多態性分子標記對隨機挑選的100株F1單株進行了純度鑒定。結果表明，18對SSR標記中有9對標記在親本材料之間具有差異性，多態性比例達到了50%。采用這些多態性標記對翠雪5號種子鑒定純度為100%，與田間鑒定結果一致。這些結果表明本研究選取的18對甜瓜基因組分子標記組成的指紋圖譜及構建的二維碼可以為翠雪5號知識產權保護提供確切的依據。同時本研究獲得的9對多態性SSR分子標記可用于快速鑒定翠雪5號種子純度，保障該品種的種子質量。

甜瓜；翠雪5號；指紋圖譜；二維碼；純度鑒定

文獻著錄格式：沈佳，壽偉松，張躍建.甜瓜翠雪5號的二維碼構建及種子純度分子檢測技術 ［J］.浙江農業科學，2015，56（12）：1946-1949.

甜瓜（Cucumismelo L.）俗稱甘瓜或香瓜，是世界上重要的果用蔬菜作物。我國為世界上最大的甜瓜生產和消費國，甜瓜種子生產量大而集中。由于國內甜瓜種子市場尚不規范，種子品牌魚龍混雜，極大地影響了育種單位和農戶的利益，常發生種子質量糾紛。目前甜瓜雜交種子生產中主要包括人工去雄、套袋等技術環節［1］，殘留的花粉容易導致自交種子的產生，致使種子純度一般難以達到100%［2］，造成商品種子質量下降，給生產帶來重大損失。因此，種子的真實性和純度是評價甜瓜種子質量最主要的因素。

目前，鑒定甜瓜雜交種子純度主要依靠田間種植檢測法，根據形態學特征進行判斷，鑒定周期長，需要耗費大量人力、物力，且易受環境因素及基因顯隱性的影響［3］。隨著分子標記技術的發展，特別是基于DNA分子標記的發展，在推動作物育種方式變革的同時，也為作物品種純度鑒定開辟了一個新的途徑。目前，DNA分子標記以其高度的個體特異性和環境穩定性，已被廣泛用于作物種子的質量檢測［4］。SSR標記技術，憑借其豐富的多態性、共顯性遺傳以及操作簡單等優點，是近些年鑒定品種和進行種子純度分析的一種較為理想的DNA分子標記技術，已被納入農作物種子品種純度鑒定的國家標準［5］。近年來隨著甜瓜基因組序列信息的公布，越來越多的甜瓜SSR等分子標記被開發應用，推動了甜瓜育種研究的同時也為甜瓜種子純度鑒定奠定了基礎。2012年，Gao等［6］通過對1 219對甜瓜基因組SSR引物篩選，獲得了具有較高多態性的18對SSR引物，為甜瓜指紋圖譜的快速構建提供了保證。

翠雪5號系浙江省農業科學院蔬菜研究所最新育成的品種，對白粉病、蔓枯病等病害有較高的抗性，具有較大的推廣應用前景。本文利用已報道的甜瓜核基因組SSR標記，同時借鑒已開發的甜瓜屬作物黃瓜的線粒體基因組SSR標記，構建翠雪5號及其親本材料的指紋圖譜及數字二維碼，為該品種的知識產權保護以及雜種純度鑒定提供理論依據及技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料種植

供試甜瓜翠雪5號單株以及親本材料 （高代自交系材料）由浙江省農業科學院蔬菜研究所西甜瓜課題組提供。于2015年4月上旬催芽后播種，4月下旬定植于海寧楊渡基地大棚設施內。大棚寬8 m，長32 m，棚面積256 m2，小區面積9.6 m2，每小區定植24株。F1單株材料采用隨機區組試驗設計，5次重復；親本種植于兩個小區，定植24株。苗期隨機挑選100株F1單株，20株親本單株掛牌取樣，放置于 -80℃冰箱，用于后續的 SSR分析及田間性狀調查。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取

采用CTAB法［7］提取100株F1單株以及親本材料各20株單株的幼嫩葉片基因組DNA，并用Nanodrop（Thermo，美國）檢測DNA質量及濃度。各個樣品DNA濃度稀釋到50 ng.μL-1，并將20個親本材料DNA等量混合，用于親本材料多態性標記的篩選。

1.2.2PCR擴增及電泳檢測

18對甜瓜核基因組 SSR引物來自 Gao等［6］，具體信息見表1，由上海英駿生物科技公司合成。SSR總反應體系為20μL，包括50 ng DNA模板，前后引物各1μmol.L-1，2×PCR Master Mix（杭州寶賽生物公司，中國）10μL。為了同時滿足不同引物退火溫度的要求，SSR擴增采用 “touchdown”PCR程序［8］，具體反應程序為94℃預變性2 min；94℃變性20 s，68℃退火1 min，72℃延伸30 s，6個循環，每個循環退火溫度降低2℃；94℃變性20 s，58℃退火1 m in，72℃延伸30 s，9個循環，每個循環退火溫度降低1℃；94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，15個循環；最后72℃再延伸5 min。PCR產物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳，180 V穩壓電泳2～2.5 h后銀染顯色，在醫用顯影燈下觀察實驗結果。

表1　所用的引物序列

1.2.3數據統計及指紋圖譜構建

針對甜瓜核基因組 SSR標記的條帶大小及分布，參考宋海斌等［9］的方法，將18對核基因組SSR引物依次編碼為A，B，C……，然后依據每對引物擴增片段的分子量從大到小的順序記錄條帶的分子量，形成字幕和阿拉伯數字組成的一系列編碼，形成該材料的核基因組SSR指紋圖譜代碼。再將材料的名稱類型以及對應的 SSR指紋圖譜代碼轉換成二維碼。

1.2.4田間純度鑒定

授粉坐瓜后30 d，針對已經取樣掛牌的100個F1單株進行田間純度鑒定，主要針對甜瓜果實性狀進行統計，分別測定果重、果實縱徑、果實橫徑、果形指數、中心折光糖度、邊緣折光糖度以及果型、果皮顏色及特征、果肉色澤、果肉質地與口感等。

2　結果與分析

2.1親本多態性引物篩選

基于前人的研究報道，本研究采用在甜瓜群體中具有高多態性表現的18對甜瓜基因組SSR引物對兩個親本DNA進行擴增，經電泳檢測，每對引物的擴增位點為1～2個，片段大小為100～600 bp。如圖1中的2和3泳道所示，9對引物（MU4104-1，CMBR097，MU9175-1，SSR00398，CMBR002，ECM147，MU5554-1，ECM150和CMBR052）在親本間具有多態性，多態性比例為50%。這些具有多態性的SSR引物可用于下一步雜交種子純度的鑒定工作。同時，各引物在親本材料中僅僅得到單一的主帶，說明經過高代自交后（＞10代自交純化），翠雪5號親本材料雜合位點較少，處于高度的純合狀態。這為準確區分親本材料，構建親本材料的DNA指紋圖譜提供了保證。當然這也是雜交制種的前提，避免了后代的分離。

圖1　9對核基因組SSR引物在部分雜交種翠雪5號以及親本材料的擴增結果電泳圖

2.2指紋圖譜構建

根據試驗方法，針對18對甜瓜核基因組SSR擴增的條帶大小，構建了翠雪5號親本材料母本以及父本的核基因組SSR指紋圖譜代碼，分別為：A180B270C100D200E195F200G275H240I120J200K2 00L240M200N200O205P175Q190R115、A180B270C120D200E195F220G290H240I130J200K165L240M24 0N245O185P200Q190R115。因此，翠雪5號的理論SSR指紋圖譜代碼為A180B270C100-120D200E 195F200-220G275-290H240I120-130J200K200-165L2 40M200-240N200-245O205-185P175-200Q190R115。然后利用在線工具碼云QR-Code（二維碼）在線生成器（http：//codeyun.sinaapp.com/qrcodegen/），我們將材料對應的名稱，類型，以及指紋代碼生成統一識別的指紋圖譜二維碼。如圖2，A包含了下列信息：名稱：翠雪5號母本，類型：甜瓜高代自交系，指紋代碼，A180B270C100D200E195F200 G275H240I120J200K200L240M200N200O205P175Q1 90R115；B包含了下列信息：名稱：翠雪5號父本，類型：甜瓜高代自交系，指紋代碼，A180B270C 120D200E195F220G290H240I130J200K165L240M24 0N245O185P200Q190R115；C包含了下列信息：名稱：翠雪5號，類型：甜瓜雜種F1，指紋代碼，A180B270C100-120D200E195F200-220G275-290H240I120-130J200K200-165L240M200-240N200-245O20 5-185P175-200Q190R115。一份材料對應一個唯一的二維碼信息，信息更加全面，在方便進行統一管理的同時利于品種的識別及知識產權的保護。

圖2　翠雪5號親本及雜種F1的指紋圖譜對應的二維碼

2.3雜交種F1純度分子鑒定

利用9對多態性的核基因組SSR標記（MU4104-1，CMBR097，MU9175-1，SSR00398，CMBR002，ECM147，MU5554-1，ECM150和CMBR052），對100株F1進行鑒定。結果顯示，9對核基因組標記在100個F1單株中均擴增出了含有雙親條帶的雜合帶型，表明這100株單株為雙親的雜交種 （圖1），體現了制種過程中去雄工作的徹底性以及防控污染的有效性。這9對DNA分子標記鑒定的結果表明，該100株單株都是真正的雜交種。因此，今后的鑒定工作中我們可以隨意挑選其中的1～2對多態性SSR標記即可快速完成對翠雪5號種子純度的鑒定，保障種子質量。

2.4雜交種F1純度田間鑒定

在甜瓜結果期對已經標記的100株翠雪5號單株進行田間性狀的觀察統計，所有單株性狀表現型一致，所統計的農藝性狀均符合翠雪5號甜瓜的性狀描述，顯示為真雜交種。因此，田間鑒定結果表明，該100株單株的品種純度為 100%，沒有混雜，與分子鑒定結果一致。

3　討論

近年來，盡管國內育種單位對種子質量的控制越來越嚴格，但是低劣種子造成的生產事件還是時有發生，不僅影響種子的聲譽及企業的利益，還會導致作物產量不穩定，影響農民的經濟效益。傳統的采用田間性狀等方法鑒定雜交種子質量，由于經常受限于環境影響，鑒定周期長，且結果不一定可靠。而基于DNA分子標記開展品種鑒定，具有多態性水平高、穩定性好、不受環境因素影響等優點，短時間內就可以準確鑒定種子純度，為作物育種及品種保護提供了便利［10］。本研究采用簡單易操作的18對核基因組 SSR分子標記檢測了翠雪5號親本材料的基因型，結果顯示，9對標記在親本材料之間存在多態性，多態性達到了50%。通過上述試驗結果，本研究成功構建了翠雪5號及其親本材料的指紋圖譜及二維碼標簽，為甜瓜品種保護提供了確切依據。同時，這9對多態性的SSR標記可有效應用于甜瓜新品種翠雪5號種子純度的快速鑒定，為其大面積推廣應用奠定了堅實的基礎。

在實際生產過程中，甜瓜雜交種子純度通常達不到100%的主要原因是雜交制種過程中去雄不徹底，導致產生少量自交種混雜。所以，甜瓜種子純度鑒定的核心是鑒別自交產生的種子。基于 SSR分子標記的共顯性特性，在得到親本材料間多態性標記的前提下，理論上能夠利用單對標記對雜交單株進行分析，快速區分雜交種和自交種。當然，在開放的制種環境下，對于其他花粉污染產生的外來雜交種混雜，則需要多對SSR標記進行驗證，在排除自交種的同時，準確判斷父本花粉來源，提高純度檢測的精確性。

［1］ 王薇，陳志剛，喬宏宇，等.用雌性系配制的薄皮甜瓜新品種 “農大8號”［J］.園藝學報，2013，40（12）：2547-2548.

［2］ 李菊芬，許玲，馬國斌.應用SSR分子標記鑒定甜瓜雜交種純度 ［J］.農業生物技術學報，2008，16（3）：494-500.

［3］ 辛景樹，郭景倫，張軟斌.幾種常用分子標記技術在種子純度和品種真實性鑒定方面的比較與分析 ［J］.種子，2005，24（1）：58-60.

［4］ 張紅，喻梅輝，周志成，等.甜瓜分子標記純度鑒定研究［J］.中國瓜菜，2006（1）：7-10.

［5］ 艾呈祥，陸璐，馬國斌，等.SSR標記技術在甜瓜雜交種純度檢驗中的應用 ［J］.園藝學報，2005，32（5）：902-904.

［6］ Gao P，Ma H，Luan F，et al.DNA fingerprin ting of Chinese melon provides evidentiary support of seed quality appraisal ［J］.PLoSOne，2012，7（12）：e52431.

［7］ 李榮華，夏巖石，劉順枝，等.改進的CTAB提取植物DNA方法 ［J］.實驗室研究與探索，2009，28（9）：14-16.

［8］ Weng Y，Li W，Devkota R，et al.M icrosatellite markers associated with two Aegilops tauschii-derived greenbug resistance loci in wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，110（3）：462-469.

［9］ 宋海斌，崔喜波，馬鴻艷，等.基于SSR標記的甜瓜品種（系）DNA指紋圖譜庫的構建 ［J］.中國農業科學，2012，45（13）：2676-2689.

［10］ 王美榮，許勇，詹永樂，等.厚皮甜瓜品種組合SSR指紋圖譜構建 ［J］.中國農學通報，2010，26（20）：47-51.

（責任編輯：張 韻）

S 652

A

0528-9017（2015）12-1946-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20151211

2015-09-11

浙江省農業新品種選育重大科技專項 （2012C12903）

沈 佳（1987-），男，浙江嘉興人，博士，從事蔬菜遺傳育種研究工作。E-mail：sjia-2009@hotmail.com。

張躍建。E-mail：zhang292001@yahoo.com.cn。