牙周非手術(shù)治療對(duì)重度慢性牙周炎患者齦溝液中MMP－8和TIMP－1水平的影響

詹 暶，林 燕，陳梅芳，李艷芬，閆福華

齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）是通過(guò)齦溝上皮和結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體，含有多種可以反映牙周的健康和疾病狀態(tài)的物質(zhì)，通過(guò)GCF的收集和分析可能以位點(diǎn)特異性的方式來(lái)評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)牙周組織的病理生理狀態(tài)［1］。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）能降解細(xì)胞外基質(zhì)的溶解酶，是牙周組織破壞的主要蛋白溶解酶，主要由炎癥滲出細(xì)胞如中性多型核白細(xì)胞和在炎癥刺激下的成纖維細(xì)胞及其他牙周膜細(xì)胞分泌［2］。有研究顯示，慢性牙周炎患者的GCF中，MMP－8占總膠原酶蛋白的80%；在活動(dòng)性牙周疾病位點(diǎn)的GCF中含量增高［3－4］。牙周非手術(shù)治療可以降低近50%的 MMP－8水平和活性［5］。MMP的含量和活性由其抑制劑（tissue inhibitiors of metalloproteinase，TIMP）調(diào) 節(jié)，其 中TIMP－1的活性范圍最廣泛，能與大部分 MMP結(jié)合［6］。因此，檢測(cè) GCF中 MMP－8和 TIMP－1的水平，可能有助于牙周病的診斷及判斷疾病的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)旨在探討牙周非手術(shù)治療對(duì)重度牙周炎患牙GCF中的 MMP－8和 TIMP－1水平的影響，并對(duì)MMP－8和TIMP－1與各臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，以期為MMP－8和TIMP－1作為GCF中牙周健康或疾病狀態(tài)的生物標(biāo)記分子提供臨床試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013年7－10月就診的慢性牙周炎患者7例，男性4例，女性3例，年齡中位數(shù)38歲（20～60歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）全身健康，無(wú)系統(tǒng)性疾病（例如糖尿病、骨質(zhì)疏松和免疫系統(tǒng)紊亂性疾病等）；（2）至少6月內(nèi)未使用過(guò)抗生素或3月內(nèi)未服用過(guò)非甾體類抗炎藥者；（3）1年內(nèi)無(wú)牙周治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠或哺乳期婦女；（2）吸煙患者；（3）口內(nèi)余留牙＜20顆；（4）正畸治療史。分別從每位受檢者口腔中選取2～4顆重度牙周炎患牙（牙周袋≥6mm，附著喪失≥5mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1／2甚至達(dá)2／3）作為試驗(yàn)牙，共20顆。

1.2 方法

1.2.1 材料和儀器 濾紙（Whatman?1號(hào)，英國(guó)Whatman公司）；旋渦混合器（HQ－60，北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）；高速離心機(jī)（LABOFUGE 400R，德國(guó)賀利氏公司）；MMP－8、TIMP－1試劑盒（福州碩博生物技術(shù)有限公司），試劑盒測(cè)試敏感度均為1.0ng／mL，檢測(cè)值范圍0～400ng／mL；刮治器（Gracey，美國(guó) Hu－Friedy公司）；潔牙機(jī)（Piezon 700型，瑞士EMS公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.2.1 GCF的采集 將1.5mL的Eppendorf管消毒備用，Whatman?1號(hào)濾紙準(zhǔn)確裁成2mm×8mm的濾紙條，在超凈臺(tái)內(nèi)紫外線消毒30min，將濾紙條翻面后再消毒30min后分裝，每2張濾紙條放入一個(gè)Eppendorf管中并編號(hào)，電子天平上稱質(zhì)量，記錄結(jié)果，密封備用。用上述消毒備用的Whatman?1號(hào)濾紙條插入實(shí)驗(yàn)牙頰側(cè)近中或遠(yuǎn)中牙周袋內(nèi)，直至遇到輕微阻力為止，30s后取出（若濾紙條上帶血，則棄之不要，另選其他牙齒）。將收集有GCF的濾紙條放置于1.5mL的Eppendorf管中，2min后用同樣方法在同一部位再次收集GCF，將濾紙條放入同一Eppendorf管中，精密電子天平稱質(zhì)量，記錄結(jié)果，并與收集GCF前的質(zhì)量相減，計(jì)算出所收集的GCF質(zhì)量，根據(jù)其比重關(guān)系（約1mg／μL）算出所得到的GCF體積，記為該牙的GCF量。稱質(zhì)量后將標(biāo)本放于－20℃冰箱保存，待樣本采集結(jié)束后同時(shí)檢測(cè)MMP－8和TIMP－1含量。

1.2.2.2 ELISA法檢測(cè)GCF中的MMP－8 和TIMP－1的含量 將治療前后收集到的所有樣本在同一日測(cè)試。實(shí)驗(yàn)前將保存于－20℃的樣本于室溫下一次性解凍，加入250μL PBS緩沖液（pH＝7.4），用旋渦混合器恒溫振蕩60min。使用高速離心機(jī)在4℃條件下以10 000r／min離心10min，去除細(xì)菌、細(xì)胞殘?jiān)入s質(zhì)。取上清液分裝到另外2個(gè)干凈的微離心管中，用MMP－8、TIMP－1試劑盒測(cè)定其中MMP－8和TIMP－1的含量。

1.2.2.3 操作步驟 采集GCF進(jìn)行牙周檢查，記錄菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）、牙周袋深度（probing depth，PD）、出血指數(shù)（bleeding index，BI）、附著喪失（attachment loss，AL）。檢查完畢后，進(jìn)行牙周非手術(shù)治療，包括口腔衛(wèi)生指導(dǎo)＋齦上潔治＋齦下刮治＋根面平整術(shù)。1月后按前述方法對(duì)所選牙重復(fù)采集GCF，并記錄各項(xiàng)牙周臨床指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 治療前后的MMP－8和TIMP－1以及臨床指標(biāo)以±s表示。統(tǒng)計(jì)分析治療前后數(shù)值的差異時(shí)，當(dāng)差值符合正態(tài)性分布時(shí)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)性分布時(shí)采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。MMP－8和TIMP－1與臨床指標(biāo)的相關(guān)分析中，若資料符合正態(tài)性分布則采用Pearson相關(guān)分析，若不符合正態(tài)性分布則采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周非手術(shù)治療對(duì)各項(xiàng)臨床指標(biāo)及 MMP－8、TIMP－1的影響 牙周非手術(shù)治療可以顯著改善各項(xiàng)臨床指標(biāo)（表1）。GCF中 MMP－8和TIMP－1水平在治療前后無(wú)顯著變化（表1）。

表1 牙周非手術(shù)治療對(duì)各項(xiàng)臨床指標(biāo)及 MMP－8、TIMP－1的影響Tab1 Clinical indices and the effects of MMP－8and TIMP－1before and after the periodontal nonsurgical treatment

2.2 MMP－8、TIMP－1水平與臨床指標(biāo)在治療前后的相關(guān)分析 除TIMP－1與治療后PLI呈正相關(guān)關(guān)系外（P＜0.05），MMP－8和 TIMP－1與其他臨床指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)性（表2）。

表2 MMP－8、TIMP－1水平與臨床指標(biāo)在治療前后的相關(guān)分析Tab2 The relationship between the levels of MMP－8and TIMP－1and different periodontal indices before and after the nonsurgical treatment

3 討 論

牙周非手術(shù)治療是最基本的牙周治療手段，已有充分證據(jù)表明，牙周非手術(shù)治療能獲得良好的療效，特別是在臨床指標(biāo)的改變方面［7－8］。本研究結(jié)果顯示，牙周非手術(shù)治療后，各項(xiàng)臨床指標(biāo)（PD、AL、BI、PLI和GCF的量）均有顯著降低，說(shuō)明牙周組織的炎癥狀況獲得改善，與以往的研究結(jié)果一致［7－8］。

有研究認(rèn)為，MMP－8與牙周的炎癥密切相關(guān)，牙周非手術(shù)治療能顯著減少 MMP－8的分泌［9－11］。但本實(shí)驗(yàn)GCF中，MMP－8的水平在治療前后無(wú)明顯變化，與Mouzakiti等的研究結(jié)果相似［12］。究其原因可能是：（1）與牙周炎的嚴(yán)重程度有關(guān)。在非手術(shù)治療前后MMP－8水平有顯著下降的實(shí)驗(yàn)中，治療前 PD 為 （6.4±0.6），（4.358±0.684），（6.3±0.68）mm，經(jīng)治療4周后下降到（4.8±0.7），（2.95±0.32），（5.04±1.35）mm，提示牙周炎癥得到良好的控制［9－11］。本試驗(yàn)選取的重度慢性牙周炎患牙，治療前后的PD為（7.3±1.38）和（6.25±1.92）mm，與 Mouzakiti 等的結(jié)果（7.1±2.1）和（5.6±1.7）mm 相似［9］。Morrison等縱向觀察了牙周非手術(shù)治療及改良Widman翻瓣術(shù)等手術(shù)治療后5年的臨床效果，結(jié)果顯示，對(duì)于深袋（PD≥7mm）部位，牙周非手術(shù)治療的療效有限，還需考慮進(jìn)一步的手術(shù)治療［13］。因此，提示本實(shí)驗(yàn)中非手術(shù)治療雖然改善了各項(xiàng)臨床指標(biāo)的數(shù)值，但實(shí)際的臨床炎癥并未得到有效控制，所以MMP－8的水平未改變。（2）與治療后的觀察時(shí)間有關(guān)。Kinane等發(fā)現(xiàn)，MMP－8的水平在非手術(shù)治療4周后無(wú)明顯改變，但3月后卻有顯著下降［5］。（3）與檢測(cè)的內(nèi)容有關(guān)。本研究檢測(cè)的是GCF中 MMP－8的含量，既往也有研究認(rèn)為，比起MMP－8的含量，MMP－8活性檢測(cè)更能區(qū)別牙周炎、牙齦炎還是牙周健康位點(diǎn)［14］。有研究采用ELISA法檢測(cè)GCF中MMP－8的水平，并以Ⅰ型膠原為底物檢測(cè)MMP－8的溶膠原活性，結(jié)果顯示，即使經(jīng)過(guò)有效的牙周治療，牙周感染位點(diǎn) MMP－8水平和溶膠原活性仍較高，且變化范圍較大［15］。關(guān)于 GCF中MMP－8的水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)分析顯示，兩者并無(wú)相關(guān)性，與既往的研究結(jié)果一致［9，12］。

TIMP是 MMP的抑制劑，關(guān)于TIMP－1的研究結(jié)果大相庭徑。Mouzakiti等發(fā)現(xiàn)，牙周非手術(shù)治療后，TIMP－1水平顯著升高［12］。筆者認(rèn)為，這可能是組織愈合過(guò)程中發(fā)生的改變，以試圖逆轉(zhuǎn)MMP造成的組織破壞。王麗琴等卻發(fā)現(xiàn)，非手術(shù)治療能顯著減少TIMP－1的分泌，原因是炎癥造成 MMP－8水平增高，使TIMP－1反應(yīng)性增高，臨床治療后，隨著 MMP－8水平的下降，TIMP－1 亦相應(yīng) 減少［10］。本研究結(jié)果顯示，治療前后GCF中TIMP－1的水平并無(wú)顯著性差異，與Marcaccini等的研究結(jié)果相似，可能是因重度炎癥時(shí)，非手術(shù)治療的療效有限，MMP－8沒(méi)有改變，TIMP－1也相應(yīng)沒(méi)有變化［16］。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TIMP－1與治療后的PLI呈正相關(guān)關(guān)系，與其他指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果都不同［9－12，16］，可能是因治療后菌斑控制不佳會(huì)使炎癥控制不佳或復(fù)發(fā)，導(dǎo)致機(jī)體反應(yīng)性增加TIMP－1，以對(duì)抗MMP造成的破壞。但上述研究在設(shè)計(jì)上存在差異，如樣本收集的時(shí)間、牙周炎的嚴(yán)重程度以及樣本的檢測(cè)方法等，使結(jié)果難以進(jìn)行直接的比較，因此還需更完善的研究以闡明TIMP－1與牙周炎的關(guān)系。

綜上所述，牙周非手術(shù)治療雖然短期內(nèi)可以改善重度牙周炎（PD≥7mm）的臨床癥狀，但不能消除牙周組織內(nèi)的炎癥和破壞。因此，有限的臨床療效不足以改變MMP－8及TIMP－1的分泌。今后的研究可從加大樣本量，延長(zhǎng)觀察期，完善牙周治療，如增加牙周手術(shù)治療后的檢測(cè)等方面來(lái)明確MMP－8和TIMP－1與牙周健康或疾病狀態(tài)間的關(guān)系。

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