星點設計-效應面法優化常春藤皂苷C提取工藝

曾建剛，孫化鵬，阮琴妹，程建宇，鐘曉紅

（湖南農業大學 園藝園林學院， 湖南 長沙410128）

洋常春藤（Hedera helix）為五加科常春藤屬的一種多年生常綠攀援藤本植物，全株可入藥[1]。現階段研究表明其主要功能成分是皂苷類化合物[2]。該類化合物具有保肝、抗腫瘤、鎮靜、止痛等多種藥理活性[3-5]。歐洲藥典和英國藥典均已收錄洋常春藤作為植物藥，其評價標準是洋常春藤干燥葉片中常春藤皂苷C 的含量不低于3%[6-8]。洋常春藤在我國分布廣泛，目前國內對洋常春藤的研究主要集中在培育、繁殖等方面[9-10]，而對于其功能成分的研究甚少，使得洋常春藤資源的利用率不高。因此，加快洋常春藤功能成分的深入研究和開發，提高洋常春藤的綜合利用價值，對于豐富我國藥用植物的研究具有十分深遠的意義。

近年來國內多采用均勻設計或正交設計法優化植物有效成分的提取工藝，這兩種設計方法均采用線性數學模型，雖然簡便、試驗次數少，但其精度不高。星點設計（CCD）[11-12]是在析因設計的基礎上采取非線性數學模型進行擬合分析，其復相關系數相對較高，預測值更精確，并具有試驗次數較少、結果直觀等優點[13-14]。本實驗采用CCD 法，并結合效應面法優化洋常春藤皂苷C 的提取工藝，為洋常春藤皂苷C 的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：洋常春藤鮮葉于2014年8月采自湖南省長沙市，洗凈后置于鼓風干燥箱中60℃烘干至恒重，粉碎后過60 目篩，密封保存備用。

試劑：乙腈、磷酸為色譜純，乙醇為分析純，超純水（自制）。常春藤皂苷C 標準品（純度≥98%）購于南京春秋生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Shimadzu 高效液相色譜儀，包括Shimadzu SPD20A 檢測器、Shimadzu SIL20A 自動進樣器、Shimadzu L C Solutions 工作站；數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；AL204 電子天平（梅特勒–托利多上海有限公司）；高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制造機械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HPLC 法測定常春藤皂苷C 含量 具體步驟如下：

（1）HPLC 檢測法色譜條件的選擇。選擇C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。二元高壓梯度洗脫：0～35 m in，20%～50%A；35～40 m in，50%～60%A。檢測波長210 nm，流速1.0 m L/m in，進樣量20 μL，柱溫25℃。

（2）標準品溶液的制備。精密稱取常春藤皂苷C標準品5.1 mg，甲醇溶解定容至5 m L，配成濃度為1.02 mg/m L 的儲備液。

（3）標準曲線的制作。分別將標準品溶液用甲醇稀釋1、2、3、4、5 倍，搖勻，按（1）項下色譜條件進樣檢測。以標準品常春藤皂苷C 的濃度（mg/m L）為橫坐標，以色譜的峰面積作為縱坐標，繪制常春藤皂苷C濃度的標準曲線。

（4）常春藤皂苷C 含量的測定。取制備好的樣品溶液，按（1）項下色譜條件測定峰面積，根據標準曲線換算出常春藤皂苷C 的含量，從而計算常春藤皂苷C得率。

1.3.2 提取工藝的優化 通過單因素試驗和星點試驗設計，進行模型擬合與數據處理，以提取優化的工藝。

（1）單因素試驗。精密稱取洋常春藤粉末3.0 g 于200 m L圓底燒瓶中，加入60 m L 一定濃度的乙醇，選取50℃、60℃、70℃、80℃、90℃不 同 水 浴 溫 度；10 m in、20 m in、40 m in、60 m in、80 m in 不同提取時間；1、2、3、4、5 不同提取次數；30%、45%、60%、75%、90%不同乙醇濃度進行回流提取，過濾，合并濾液，按1.3.1（4）的方法測定常春藤皂苷C 的含量，并計算出常春藤皂苷C 的得率。

（2）星點試驗設計。為了更精確地研究各因素的最佳水平值，在單因素試驗結果分析的基礎上，取回流溫度（x1）、乙醇濃度（x2）、提取時間（x3）作為自變量，設定因素水平表，見表1。因提取次數為非連續的變量，不能夠進行回歸處理，結合單因素實驗和生產實際，均設定為兩次。稱取常春藤粉末3.0 g 于200 m L圓底燒瓶中，加入60 m L 一定濃度的乙醇，置于水浴鍋中回流提取，過濾，合并濾液，HPLC 法測定溶液中常春藤皂苷C 含量。

（3）模型擬合與數據處理。本實驗使用Design–Expert 8 軟件進行數據分析。采用效應面分析方法，進行多元線性回歸及二項式擬合，并對擬合出的較優方程模型進行方差分析。以擬合方程的r 和P 值為指標，選擇P 和r 較佳的方程作為模型。依據模型方程來繪制響應面三維立體圖及等高線。因為效應曲面圖為三維圖，只能表示出其中兩個自變量的函數，所以，分別固定3個自變量中的一個為中值，在擬合目標函數的基礎上，繪制因變量三維立體效應面圖。利用該效應面三維圖對任意2個自變量的交互作用進行分析及評價。利用Design-Expert 8 軟件中Optimization模塊的Point Prediction 功能分析預測最佳提取工藝條件，并進行驗證實驗，最終得出常春藤皂苷C 的最佳提取工藝條件。

表1 星點設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 常春藤皂苷C 的HPLC 檢測法的建立

通過不斷調整流動相比例，在1.3.1（1）項下二元高壓梯度洗脫時，樣品溶液色譜圖基線平穩，不同組分分離度較好，由此確定常春藤皂苷C 的HPLC 檢測法的色譜條件。

得常春藤皂苷C 濃度的標準曲線方程為：Y=1.7×106X-7 972.3，R2=0.999 3。結果表明，常春藤皂苷C 的濃度與峰面積線性關系良好，HPLC 法測定常春藤皂苷C 的含量有效可行。

2.2 提取工藝的優化結果

2.2.1 單因素試驗結果 單因素試驗結果如圖1，由圖1 可知，常春藤皂苷C 提取的最佳單因素實驗條件為：回流溫度70℃，乙醇濃度75%，提取時間70 min，提取次數由于2 次后變化不大，考慮工業生產成本和實際，均定為2 次。在上述最佳單因素條件下，常春藤皂苷C 最佳得率為3.51%。

2.2.2 星點設計試驗結果 根據單因素實驗結果，確定星點設計因素范圍。由于非連續變量不能夠進行回歸處理，綜合考慮生產實際，提取次數均設定為2 次，星點設計試驗結果見表2。

2.2.3 模型擬合與效應面分析

（1）模擬方程。用Design–Expert 8 軟件進行數據分析，以因變量分別對自變量進行多元線性回歸和二項式擬合。所得常春藤皂苷C 得率的線性回歸方程為：

y=2.685 51＋0.004 22x1＋0.003 16x2＋0.002 89x3(r=0.135 4，P>0.05)。擬合度較差，模型不合格，因此多元線性模型不合適。

圖1 溫度（A）、乙醇濃度(B)、提取時間(C)、提取次數(D)對常春藤皂苷C 提取得率的影響

表2 星點設計試驗結果

得到常春藤皂苷C 得率非線性二次方程為：

y=－0.477 28＋0.019 985x1＋0.092 326x2＋0.011 827x3＋3.64×10-6x1x2－6.20×10-6x1x3＋9.06×10-5x2x3－1.21×10-4x12－7.79×10-4x22－1.55×10-4x32(r=0.984 5，P＜0.01)

由上述方程可知，二項式方程的r 值要高于線性方程，且P＜0.01，表明二項式方程具有高度的顯著性，模型與實際擬合較好，實驗誤差小，利用星點設計來優化常春藤皂苷C 的提取是可行的。對二項式方程的回歸模型進行顯著性檢驗，方差分析結果見表3。結果表明，方程的一次項對常春藤皂苷C 得率的線性效應均表現為極顯著（P＜0.01）；二次項中，各個因素對常春藤皂苷C 得率的曲面效應影響均顯著；其中x2x3的P＜0.05，說明乙醇濃度與提取時間交互作用顯著，其他因素間的交互作用不顯著。

（2）效應面分析。根據二項式方程，固定3個自變量之一為中值，應用Design–Expert 8 軟件作三維效應面圖（圖2～圖4），由圖2～圖4 可以看出，3個因素對常春藤皂苷C 得率的影響順序是：乙醇濃度>提取時間>回流溫度。乙醇濃度與提取時間這2個因素間的交互作用顯著，回流溫度與乙醇濃度、提取時間之間的交互作用影響不顯著。常春藤皂苷C 得率的較佳工藝范圍為乙醇濃度60%～70%，回流溫度70～85℃，提取時間45～60 m in。通過軟件分析，得出回歸模型的最大值點，即常春藤皂苷C 的最佳提取工藝條件為乙醇濃度62.6%，回流溫度82.3℃，提取時間54.7 m in，回流提取2 次。在此條件下，常春藤皂苷C的預測得率為3.56%。

表3 擬合二項式方程方差分析

圖2 乙醇濃度與回流溫度對常春藤皂苷C 得率的效應面圖

圖3 提取時間與回流溫度對常春藤皂苷C 得率的效應面圖

圖4 提取時間與乙醇濃度對常春藤皂苷C 得率的效應面圖

（3）優化結果的驗證。按照得出的最佳提取工藝條件進行5 次驗證試驗，結果表明，最佳工藝提取的常春藤皂苷C 得率的平均值為3.52%。其結果與擬合方程的預測值3.56%較吻合，偏差值為0.04個百分點。表明所建立的數學模型具有良好的預測性，由數學模型所得的最佳條件與設計目標相符合。

3 討論

本實驗通過采用星點設計- 效應面法得出了回流溫度、乙醇濃度、提取時間對常春藤皂苷C 的效應趨勢，優化了常春藤皂苷C 的提取工藝。充分考慮到了各因素間的交互作用，設計方法簡便，精度高，試驗次數少。并且此方法模型擬合的復相關系數較高，可信度好，結果直觀，便于分析。經過驗證，該方法優化常春藤皂苷C 提取準確可行。

通過回歸分析和驗證，得到常春藤皂苷C 最佳提取工藝條件乙醇濃度62.6%，回流溫度82.3℃，提取時間54.7 min，回流提取2 次。在此條件下，常春藤皂苷C 的得率為3.52%，該得率比單因素實驗中最佳得率更高，且提取成本降低，說明方程模型有較好的應用價值。利用星點設計-效應面法優化常春藤皂苷C提取是有效可行的。該研究可為常春藤皂苷C 的工業化生產提供參考依據，有效提高原料利用率。

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