5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性

戴欣，常靜，李濟彤，楊淞霖，李建中,王會利

中國科學院生態環境研究中心 中國科學院環境生物技術重點實驗室，北京 100085

5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性

戴欣，常靜，李濟彤，楊淞霖，李建中,王會利

中國科學院生態環境研究中心 中國科學院環境生物技術重點實驗室，北京 100085

酚類物質作為一類主要的污染物，已引起國內外高度重視，但目前其對陸生生物的毒性研究較少。本試驗探究了4-叔丁基苯酚、間甲酚、2-氯苯酚、2-甲酚、2,4-二氯苯酚這5種酚類物質對中國本土物種中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性。在中國白羽鵪鶉的急性經口試驗中，2-氯苯酚、2-甲酚的7 d的半致死濃度(7 d-LC50)分別為331 mg·kg-1和413 mg·kg-1，其他3種酚類物質的7 d-LC50均大于限度值1 000 mg·kg-1；在中國白羽鵪鶉的急性飼喂試驗中，5種酚類物質的8 d-LC50均大于限度值 2 000 mg·kg-1；在中華蜜蜂的急性經口試驗中，2-氯苯酚、2-甲酚和2,4-二氯苯酚的48 h-LC50分別為306 mg·L-1、358 mg·L-1和364 mg·L-1；在中華蜜蜂的急性接觸試驗中，2,4-二氯苯酚的48 h的半致死量(48 h-LD50)為2.6 μg·蜂-1，其他4種酚類物質的48 h-LD50均大于限度值100 μg·蜂-1。研究結果表明不同的酚類物質由于其結構不同亦表現出不同的毒性，甲酚的鄰位取代比間位取代對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的毒性更高，不同物種表現出了相似的規律性。5種酚類物質對我國本土物種中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂毒性比對其他水生生物更敏感，存在良好的劑量效應關系。

酚類物質；中國白羽鵪鶉；中華蜜蜂；急性毒性

酚類化合物是指芳香環與羥基相連的一大類有機化合物，是美國國家環境保護局(U.S. EPA)列出的129種優先控制污染物之一[1],同時多種酚類污染物也被列入中國水中優先控制污染物黑名單[2]。酚類化合物是重要的化工原料，其應用非常廣泛。環境中酚污染主要來自焦化廠、煉油、木材防腐、絕緣材料的制造、制藥、造紙以及酚類化工廠的廢水、廢氣等。

酚類化合物可通過大氣沉降、污水灌溉和土壤吸附等途徑，進入土壤環境。由于煉油廠等的污水排放或者固體廢物的堆放，會造成煉油廠或煉油廠退役場地附近土壤受到酚類物質的污染[3]。隨著含酚廢水排入排污河，排污河沿線的土壤也會受到酚類物質的污染[4]。同樣，污水灌溉或者農藥的施用，均會使農田土壤受到酚類物質的污染[5]。然而，目前人們普遍關注的是酚類物質對水生環境的影響，而酚類物質對陸生生物的影響卻少有研究[6-7]。

經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)關于化學品風險評價的指導準則中，蜜蜂[8-9]和鳥類[10-12]作為陸生生物的代表物種，是重要的陸生模式生物。鳥類是脊椎動物的第二大類群，在害蟲防治等方面，發揮著重要的生態功能，也是衡量生態平衡的重要標志。蜜蜂是另外一種重要的非靶標生物，是自然界數量最多的傳粉昆蟲。然而，相較于水生生物，酚類物質對鳥類和蜜蜂的毒性研究還相對較少。目前國際上主要以日本鵪鶉和意大利工蜂作為鳥類和蜜蜂的通用模式物種。然而，因不同國家和地區在生物區系、自然環境等方面差別較大，本地物種與通用種對同種化學品的敏感性可能存在差異。選擇適當的本土物種并將其應用于化學品的環境風險評價對維護生態系統穩定、保持本國的生物多樣性具有重要意義。中國白羽鵪鶉是我國自行培育的、目前飼養的主要鵪鶉品種，中華蜜蜂則是我國獨有的蜜蜂品種，屬于東方蜜蜂(Apis cerana)的中國亞種。因此我們選用這2種本土物種作為受試生物，對5種酚類物質的急性毒性效應進行了研究,探討將中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂等本土物種引入化學品環境風險評價中的重要性以及可行性。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1試驗材料

1.1.1試驗生物

中國白羽鵪鶉(Chinese recessive white feather quail)由實驗室自行飼養與繁育。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)成年工蜂由北京市密云縣中華蜜蜂谷提供，經實驗室自行飼養與繁育。

1.1.2供試藥劑

4-叔丁基苯酚、間甲酚、2-氯苯酚、2-甲酚、2,4-二氯苯酚，均為分析純，購自國藥集團化學有限公司。

1.1.3試驗器材

試驗鵪鶉籠采用的金屬網孔籠，規格為80 cm(長) × 50 cm(寬) × 50 cm(高)，并配備有盛裝食物和水的容器。試驗蜂籠規格為：14.4 cm(長) × 10.5 cm(寬) × 12.4 cm(高)，上下以紗網襯里的木質蜂籠，木板厚度為1 cm左右，紗網孔徑為2.5 mm。

1.2試驗方法

1.2.1中國白羽鵪鶉的實驗室規模化飼養及馴化

中國白羽鵪鶉在14日齡之前溫度維持在(35±3) ℃，濕度維持在50%～70%。14日齡后，溫度每天降低1 ℃，最終保持在(25±2) ℃，濕度不變。對于10日齡之前的幼體鵪鶉的飲用水應為溫水(溫度約為室溫)，24 h光暗比為20 h∶4 h，光照時間逐日遞減1 h，直至達到自然光照水平。

在進入成熟期(40日齡)后，將中國白羽鵪鶉按雌雄比3∶1進行分籠飼養。每天收集鵪鶉卵，收集到一定數量的鵪鶉卵后便可放入孵化箱內進行孵化。鵪鶉卵的儲存條件為：溫度15 ℃～16 ℃，濕度55%～75%；鵪鶉卵的孵化條件為：溫度37.5 ℃，濕度70%～75%，孵化時間約為14 d。

在進行試驗前，飼養的中國白羽鵪鶉需轉入試驗用鵪鶉籠中進行馴化，馴化時長約為1周。在馴化期間，若死亡率小于5%，則可以選取健康情況和大小較為相近的鵪鶉進行試驗。

1.2.2中華蜜蜂的實驗室規模化飼養及馴化

將飼養中華蜜蜂的蜂箱置于實驗室外搭建的敞口雨棚下，定期查看蜜蜂釀蜜情況，酌情給予一定的蔗糖水防止食物短缺。冬季天冷后，于蜂箱內添加隔溫板，往蜂排上添加一定量蜂蜜水以備蜂群過冬，并于蜂箱上添加稻草保暖。

飼養后的蜂群在試驗前需要轉入到試驗用蜂籠進行為1周的馴化，在馴化期間，沒有出現明顯死亡狀況，且使用樂果標準品為參比試驗時結果未出現明顯波動時，再選取身體健康、大小一致的工蜂進行毒理試驗。

1.2.3試驗方法的建立

中國白羽鵪鶉急性經口毒性試驗參照《化學農藥安全評價實驗準則》、EPA及OECD相關準則[13]。試驗所用的鵪鶉應來自同一批次，約為40日齡，體重為(100±10) g，健康活潑。試驗前一天停止喂食，僅供清水。室溫在(25±2) ℃，光照采用自然光照。根據預試驗設置5個劑量組，每組10只鵪鶉，雌雄各半，并設置空白對照組。供試鵪鶉以經口灌注法一次性給藥1.0 mL·(100 g體重)-1，連續7 d觀察記錄鵪鶉的死亡情況以及中毒癥狀，求出LD50及95%置信限。

中國白羽鵪鶉急性飼喂毒性試驗參照《化學農藥安全評價試驗準則》、EPA及OECD相關準則。試驗所用的鵪鶉應來自同一批，約為40日齡，體重為(100±10) g，健康活潑。試驗前一天停止喂食，僅供清水。室溫在(25±2) ℃，光照采用自然光照。根據預試驗設置5個劑量組，每組10只鵪鶉，雌雄各半，并設置空白對照組。用含不同濃度藥劑的飼料飼喂鵪鶉5 d，從第6天開始，以不含被試物的正常飼料連續飼喂3 d，觀察記錄鵪鶉的死亡情況以及中毒癥狀，求出LC50及95%置信限。

中華蜜蜂急性經口毒性試驗參照《化學農藥安全評價實驗準則》，采用的是“小燒杯法”[14]。試驗在人工氣候箱中進行，溫度控制在(25±1) ℃，濕度控制在60%左右。根據預試驗設置5個劑量組。每組20只蜜蜂，每個濃度設置3個重復，并設置空白對照。于試驗開始后第24小時和第48小時檢查各濃度組蜜蜂的死亡情況。求出48 h-LC50及95%置信限。

中華蜜蜂急性接觸毒性試驗參照《化學農藥安全評價實驗準則》及OECD相關準則。試驗在人工氣候箱中進行，溫度控制在(25±1) ℃，濕度控制在60%左右。根據預試驗設置5個劑量組。每組20只蜜蜂，每個濃度設置3個重復，并設置空白對照。將約1 μL的藥劑點于蜜蜂的前胸背板處，于試驗開始后第24小時和第48小時檢查各濃度組蜜蜂的死亡情況。求出48 h-LD50及95%置信限。

1.2.4數據處理

使用SPSS數據處理軟件，進行Probit線性回歸分析，得到其回歸方程、LD50或LC50，及其95%置信區間[15]，并記錄其顯著性值。

2　結果(Results)

5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性試驗結果見表1。研究結果表明，在急性經口毒性試驗中，2-氯苯酚和2-甲酚對中國白羽鵪鶉表現出了較為明顯的毒性。在給藥約3 min后，鵪鶉出現明顯的羽毛豎立、萎靡等癥狀。而在高劑量時，鵪鶉羽毛豎立的同時，伴隨著站立不穩的癥狀，隨即出現有鵪鶉倒地，直至死亡。2-氯苯酚和2-甲酚對中國白羽鵪鶉的7 d-LD50分別331 mg·kg-1體重和413 mg·kg-1體重。參考《化學農藥環境安全評價準則》中的毒性分級標準(以下毒級評價均參照此標準)，這2種酚類物質對中國白羽鵪鶉的急性經口毒性均屬于中毒。2-氯苯酚、2-甲酚對中華蜜蜂的48 h-LC50分別為306 mg·L-1、358 mg·L-1，參照標準，這3種酚類物質對中華蜜蜂的急性經口毒性屬于低毒。

2,4-二氯苯酚對中國白羽鵪鶉的7 d-LD50以及8 d-LC50分別超過限度值1 000 mg·kg-1體重和2 000 mg·kg-1飼料，參照標準，這2種酚類物質對中國白羽鵪鶉的急性毒性均為低毒。2,4-二氯苯酚對中華蜜蜂的48 h-LC50為364 mg·L-1，為低毒。而其對中華蜜蜂的48 h-LD50為2.6 μg·蜂-1，表現為中毒。

表1　5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性

4-叔丁基苯酚和間甲酚對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性均為低毒。對于半致死濃度低于限度濃度的試驗結果包括回歸方程、LD50或LC50、95%置信區間和顯著性值見表2。

3　討論(Discussion)

根據以上試驗結果，參考《化學農藥環境安全評價準則》中的毒性分級標準，除2-氯苯酚、2-甲酚對中國白羽鵪鶉的急性經口毒性為中等毒性，以及2,4-二氯苯酚對中華蜜蜂的急性接觸毒性為中等毒性外，其余的急性毒性試驗結果均為低毒。

2-氯苯酚對黑頭呆魚的96 h-LC50>10 mg·L-1，屬于低毒[16]，對月牙藻的半效應濃度(EC50)為20.55 mg·L-1，屬于低毒[17]；2,4-二氯苯酚對黑頭呆魚的96 h-LC50為8.3 mg·L-1，屬于中毒[17]，對月牙藻的EC50為4.2 mg·L-1，屬于低毒[16]。可見，隨著苯酚中氯取代的增加，其對黑頭呆魚以及月牙藻的毒性也增加。而對于中國白羽鵪鶉，2,4-二氯苯酚的急性經口毒性反而要低于2-氯苯酚。但在蜜蜂的急性接觸毒性中，2,4-二氯苯酚的毒性明顯要高于2-氯苯酚，LD50分別為2.6 μg·蜂-1以及大于100 μg·蜂-1。這可能是由于隨著氯取代的增加，其脂溶性更強，從而更容易進入中華蜜蜂體內，造成更嚴重的毒害。同樣，如果氯取代繼續增加，其對大型溞的毒性也會出現顯著增加。2,4-二氯苯酚對大型溞的48 h-LC50為2.48 mg·L-1，而2,4,5-三氯苯酚對大型溞的48 h-LC50為0.46 mg·L-1[18]。

對甲酚和對氯酚對食蚊魚(Gambusia affinis)的96 h-EC50分別為33 mg·L-1和21 mg·L-1[19]，均為低毒。可見對位取代基為甲基或者氯時，對氯酚和對甲酚對食蚊魚表現出了相似的毒性。2-氯苯酚對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的毒性與2-甲酚對它們的毒性較為接近，毒級均為中毒。

對微生物的毒性研究表明，對甲酚、鄰甲酚和間甲酚對I型假單孢桿菌的毒性依次降低，而對于II型假單孢桿菌，鄰甲酚毒性最高，間甲酚次之[20]。由此可以看出，甲酚的鄰位取代比間位取代對假單孢桿菌的毒性更高。類似，我們發現鄰甲酚(2-甲酚)對中國白羽鵪鶉的急性經口的毒性表現為中等毒性，而間甲酚的中國白羽鵪鶉的急性經口毒性的LD50則大于1 000 mg·kg-1體重，表現為低毒；鄰甲酚對中華蜜蜂的急性經口毒性的LC50為358 mg·L-1，而間苯酚對中華蜜蜂的急性經口毒性的LC50則大于2 000 mg·L-1。可見，甲酚的鄰位取代比間位取代對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的毒性更高。

這5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的毒性與對其他水生生物的毒性表現出了相似的規律性。但是，中國白羽鵪鶉或中華蜜蜂對某些酚類物質可能比水生生物更敏感。

陸生生態系統中，鳥類和蜜蜂是重要的受試生物。在目前的化學品環境風險評價中，仍以日本鵪鶉，意大利工蜂作為鳥類和蜜蜂的代表物種。然而，由于本土物種與通用種在體型或者生理上的差別，可能會導致其對化學品的敏感性存在差異[21]。如果本土物種對化學品更敏感，那么我們應該考慮將其作為受試生物用于化學品風險評價。我們實驗室通過對比5種農藥對中華蜜蜂和意大利工蜂的急性毒性發現，中華蜜蜂對這5種農藥更為敏感，更適于農藥的毒理學評價[22]。也有研究表明，東方蜜蜂印度亞種與意大利工蜂對多種農藥的敏感性表現出了較為明顯的差異。而在印度，已將當地的東方蜜蜂印度亞種作為常用的試驗動物[23]。關于其他模式生物的本土化也有相關研究[24]。

表2　3種酚類物質對中國白羽鵪鶉及中華蜜蜂的急性毒性及其95%置信區間

中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂是中國鳥類和蜜蜂中具有代表性的本土物種，均已實現實驗室的規模化飼養，并且對上述5種酚類物質呈現出良好的劑量效應關系，因此，我們可以考慮將它們作為化學品環境風險評價的受試生物。化學品對本土物種的毒性效應長期受到忽視，毒性數據也較為缺乏。在以后的研究中，我們應該繼續積累化學品對本土物種的毒性數據，并將本土物種作為化學品環境風險評價的受試生物，這對本土物種以及生態環境的保護具有重要意義。

通訊作者簡介：王會利(1976—)，女，副研究員，主要研究方向為農藥環境行為及環境毒理。

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Acute Toxicities of Five Phenols to Chinese Recessive White Feather Quail andApisceranacerana

Dai Xin, Chang Jing, Li Jitong, Yang Songlin, Li Jianzhong, Wang Huili

CAS Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

20 November 2014accepted 3 March 2015

Phenols are a kind of wide-spread contaminants and their toxicity to terrestrial organisms are less known. Acute toxicity studies were conducted by using the Chinese native species, Chinese recessive white feather quail (CWQ) and Apis cerana cerana (ACC), to estimate the median lethal dose/median lethal concentration of phenols. The 7 d-LD50of oral toxicity experiment of 2-chlorophenol and o-cresol to CWQ were 331 mg·kg-1and 413 mg·kg-1, respectively. The 48 h-LC50of 2-chlorophenol, o-cresol and 2,4-dichlorophenol to ACC were 306 mg·L-1, 358 mg·L-1and 364 mg·L-1, respectively. The 48 h-LD50of 2,4-dichlorophenol to ACC was 2.6 μg·bee-1. The 2-chlorophenol and o-cresol are moderately toxic chemicals to CWQ in acute oral toxicity test, and 2,4-dichlorophenol is moderately toxic chemical to ACC in acute contact toxicity test. The other chemicals are low toxic chemical to CWQ and ACC. Further more, we discovered that the toxicity of phenols is related to their chemical structure. The toxicity of o-cresol is higher than m-cresol to CWQ and ACC. Similar situation was discovered for other organisms. CWQ and ACC are sensitive to these five phenols and significant dose-effect relationship were also discovered.

phenols; Chinese recessive white feather quail; Apis cerana cerana; acute toxicity.

科技部863計劃資源環境領域重大項目(No．2012AA06A302)； 國家自然科學基金項目(No．21477152)

戴欣(1989-)，男，碩士，研究方向為生態毒理學，E-mail: xindai_st@rcees.ac.cn；

Corresponding author)， E-mail: huiliwang@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141120002

2014-11-20 錄用日期：2015-03-03

1673-5897(2015)6-281-06

X171.5

A

戴欣, 常靜, 李濟彤, 等. 5種酚類物質對中國白羽鵪鶉和中華蜜蜂的急性毒性[J]. 生態毒理學報，2015, 10(6): 281-286

Dai X, Chang J, Li J T, et al. Acute toxicities of five phenols to Chinese recessive white feather quail and Apis cerana cerana [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 281-286 (in Chinese)