6種重金屬對3種海水養殖生物的急性毒性效應

秦華偉，劉愛英，谷偉麗，陶慧敏，李佳蕙，李斌，孫珊，姜會超

山東省海洋資源與環境研究院　山東省海洋生態修復重點實驗室，煙臺 264006

6種重金屬對3種海水養殖生物的急性毒性效應

秦華偉，劉愛英，谷偉麗，陶慧敏，李佳蕙，李斌，孫珊，姜會超*

山東省海洋資源與環境研究院山東省海洋生態修復重點實驗室，煙臺 264006

以主要海水養殖動物菲律賓蛤仔、刺參、褐牙鲆為研究對象，采用靜水毒性法評價了重金屬對海洋生物的毒性效應，分別將受試動物暴露于不同濃度梯度的重金屬Cd、Cr、Cu、Zn、Hg及As單種試液中，概率單位法求得半致死質量濃度。結果表明，同一種重金屬對3種不同養殖生物的毒性存在明顯差異(P<0.05)，Hg對菲律賓蛤仔、刺參及褐牙鲆3種養殖生物的96 h-LC50分別為0.134 mg·L-1、0.0246 mg·L-1及0.238 mg·L-1；Cu為0.323 mg·L-1、0.0499 mg·L-1及0.975 mg·L-1；As為2.464 mg·L-1、0.301 mg·L-1及8.345 mg·L-1；Cd為2.843 mg·L-1、1.111 mg·L-1及6.787 mg·L-1；Zn為30.246 mg·L-1、0.449 mg·L-1及17.114 mg·L-1；Cr為32.591 mg·L-1、2.205 mg·L-1及95.137 mg·L-1。6種重金屬對菲律賓蛤仔毒性強弱：Hg>Cu>As>Cd>Zn>Cr；對刺參毒性：Hg>Cu>As>Zn>Cd>Cr；對褐牙鲆毒性：Hg>Cu>Cd>As>Zn>Cr。綜合結果表明：Hg、Cu毒性最強，Cd、As及Zn次之，Cr毒性最弱。研究結果可為海水增養殖區重金屬風險評價提供理論依據。

重金屬；菲律賓蛤仔；刺參；褐牙鲆；急性毒性；半致死質量濃度

海洋重金屬污染是全球關注的熱點問題之一。據報道，我國每年有大量的重金屬通過各種人類活動進入到海洋環境中，嚴重影響海洋魚、參、貝等常見經濟生物的繁殖、生長、發育和存活[1-4]。如何正確認識、評價重金屬污染對海洋經濟生物的毒性大小，預防重金屬污染對海洋生物及海水養殖業造成損失已成為亟待解決的問題。長久以來，大量學者就重金屬對海洋生物的毒性效應展開了大量的研究，但大多數研究集中在重金屬對某一單一物種的毒性研究[5-7]。而且不同物種對同一種重金屬的敏感性也有差異[8]，由單一物種得出的重金屬毒性大小往往難以適用于其他物種。3為了探討重金屬對不同海洋生物的毒性差異，本研究選取了菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)、刺參(Apostichopus japonicus)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)種主要的養殖生物，采用靜水毒性實驗方法，研究了6種重金屬Cd、Cr、Cu、Zn、Hg、As對3種養殖生物的毒性大小及其差異，以期為正確評價重金屬對海洋生物的毒性效應，制定海水增養殖區重金屬風險評價方法提供理論依據。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1試劑

所有試劑均為分析純。氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)、氯化汞(HgCl2)、重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、醋酸鋅(C4H6O4Zn·2H2O)、三氧化二砷(As2O3)為國藥集團化學試劑有限公司產品；硫酸銅(CuSO4·5H2O)為天津瑞金特化學品有限公司產品。實驗前先將各試驗藥物配制成一定質量濃度的母液(As2O3需先經NaOH溶解，再經H2SO4中和)，再用同源的過濾海水稀釋成實驗所需各種濃度，各組濃度進行一定比例的抽測，確保所配制濃度的準確性。

1.2試驗生物

試驗生物3種。菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum )殼長(3.16±0.12) cm，自煙臺牟平養馬島附近海域低潮區人工采捕。刺參(Apostichopus japonicus)及褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)取自東方海洋科技股份有限公司育苗場，為人工繁育，其中刺參濕重1.3～1.5 g，褐牙鲆體長(14.1±1.1) cm。菲律賓蛤仔、刺參及褐牙鲆實驗室暫養2 d，暫養期間持續微量充氣，不投餌。暫養期間如死亡率≤2%，則挑選規格基本一致、體表無損傷、活動正常，對外界刺激反應靈敏的健康個體進行下一步試驗。

1.3試驗條件

試驗采用靜水實驗法。實驗室采用白窗簾遮光，光照周期為自然光。試驗期間不投餌，不換水，連續微量充氣；及時清除并記錄死亡個體，試驗進行96 h。試驗用海水取自煙臺四十里灣，砂濾過濾，pH 8.0～8.2，溶解氧7.1～8.5 mg·L-1，鹽度30.8～31.5，試驗水溫(17.0±1) ℃。經山東省海洋環境監測中心檢測，海水中重金屬背景值：Cd 0.0271 μg·L-1，Cr 0.337 μg·L-1，Cu 2.91 μg·L-1，Hg 0.0673 μg·L-1，Zn 43.5 μg·L-1，As 1.53 μg·L-1(重金屬含量前處理及測定方法參照GB17378.4—2007《海洋監測規范》進行，其中Cu、Cd、Zn、Cr采用原子吸收法，Hg、As采用原子熒光法)，其濃度值比試驗設計的最低濃度低1～4個數量級，因而制備試液時不予考慮其影響。預實驗確定最高全存活濃度及最低全致死濃度，作為正式試驗的濃度范圍。正式試驗按等比組距(組距比值1.4～2.2)設計6～8個濃度組(見表1)，每組3平行，另設一對照組，對照組設3平行。

試驗容器為60 cm×45 cm×35 cm玻璃水族缸。每組隨機放入試驗生物，菲律賓蛤仔、刺參及褐牙鲆每組試驗的初始數量分別為20只、20只、10尾，水體分別為40 L、30 L、40 L。

1.4數據記錄及處理

試驗生物死亡的判定標準：菲律賓蛤仔貝殼張開，玻璃棒觸之，無反應，或貝殼微張、水管伸出，對刺激無收縮反應；刺參落于缸底，無附壁能力，玻璃棒觸之，無收縮反應，或皮膚潰爛；褐牙鲆鰓部無呼吸運動，身體僵硬、附于玻璃鋼底部，用玻璃棒輕觸魚尾部，無反應或反應極弱。

表1　急性毒性試驗中重金屬的濃度設置

記錄觀察到的死亡及異常的個體數，取3個平行組平均值計算死亡百分率；依據死亡百分率查出對應的概率單位；并依據金屬離子試驗濃度算出其濃度對數一并記入。要求各平行組死亡率之差小于20%，否則重新進行該濃度組試驗。

概率單位法計算半致死濃度(LC50)。根據濃度對數-概率單位直線回歸方程，分別求出24 h、48 h、72 h及96 h半致死濃度(LC50)及其95%置信區間。

LC50的95%可置信限根據下式求得：

式中：S—標準差，即相當于線性回歸直線的斜率的倒數。

N—死亡率在16%～84%范圍內的各組受試生物的總數。

2　結果(Results)

2.1重金屬對菲律賓蛤仔的急性毒性

不同重金屬實驗組中菲律賓蛤仔行為反應不盡相同，但試驗開始后，高濃度組大都經歷閉殼躲避—張殼呼吸—中毒麻痹—死亡4個階段。菲律賓蛤仔閉殼數隨重金屬離子濃度的增加，基本呈現上升趨勢，As各試驗梯度蛤仔張殼數量無明顯規律。在Cu及Hg低濃度組出現白色點塊狀物體，經組織切片觀察，發現多為無固定形狀的組織碎渣，內有少量的纖毛細胞。白色脫落物隨著時間的延長呈增加趨勢，但在Cu及Hg高濃度組白色脫落物較少出現，可能與菲律賓蛤仔一直保持閉殼躲避行為有關。

試驗初始階段，菲律賓蛤仔通過緊閉雙殼避免不良環境的侵擾，相比較于其他生物種類，死亡現象滯后。在24 h內，6種重金屬不同濃度組內基本未見死亡個體，在48 h內，Cu及Hg各試驗組菲律賓蛤仔基本處于閉殼狀態，難以判定是否死亡。

6種重金屬離子對菲律賓蛤仔的濃度效應關系、半致死濃度(LC50)及95%置信區間見表2所示。對照組中菲律賓蛤仔的死亡率均為0，符合急性毒性試驗標準方法的要求。從表2中可以看出，在96 h內，隨著暴露時間延長，重金屬對菲律賓蛤仔的毒性基本呈現增大的趨勢。菲律賓蛤仔對不同重金屬的耐受性具明顯差異，Cr對菲律賓蛤仔的96 h-LC50是Hg的243倍。以96 h-LC50為依據，6種重金屬離子對菲律賓蛤仔的急性毒性強弱為：Hg>Cu>As>Cd>Zn>Cr。

2.2重金屬對刺參的急性毒性

低濃度組刺參大多數個體附于池壁，體表褐色或綠褐色，肉刺尖挺，其活動狀況、體表表現與對照組基本相似；較高濃度組刺參很快落于池底，身體扭動、翻滾，或身體及口觸手充分拉長，表現出焦躁不安或麻痹、癱軟癥狀；更高濃度組身體則蜷縮成球，肉刺變得圓鈍，內臟排出，隨著試驗時間延長，皮膚潰爛，直至死亡。刺參面對不同重金屬的毒性反應不盡相同，刺參體表潰爛程度：Hg>Cu>Cr>Cd ≈ Zn>As；刺參排臟程度：Zn最嚴重，其次是Cr及As，其他種類重金屬實驗組則相對較輕；參體拉長程度：Zn>Cu>Cd>Cr>As>Hg。刺參急性毒性癥狀見表3。

表2　重金屬對菲律賓蛤仔的急性毒性分析

注：y表示死亡率的概率單位，x表示重金屬離子濃度對數。

Note:y represents the probability unit of death rate, x represents the logarithms of heavy metal concentration.

表3　暴露于重金屬后刺參急性毒性癥狀

6種重金屬離子對刺參的濃度效應關系、半致死濃度(LC50)及95%置信區間見表4所示。對照組中刺參死亡率均為0，符合急性毒性試驗標準方法的要求。從表中可以看出，在96 h內，隨著暴露時間延長，重金屬對刺參的毒性基本呈現增大的趨勢。刺參對6種重金屬毒性均很敏感，重金屬間耐受差異性小于菲律賓蛤仔，6種重金屬的96 h-LC50范圍為0.0246～2.205 mg·L-1。以96 h-LC50為依據，6種重金屬離子對刺參的急性毒性由強至弱依次為：Hg>Cu>As>Zn>Cd>Cr。

2.3重金屬對褐牙鲆的急性毒性

牙鲆屬底棲性魚類，正常情況下多附于容器底部。低濃度組的魚活動狀況與對照組基本相似，大多安靜地趴在池底。高濃度組褐牙鲆入水后大多很快表現出焦躁不安，狂游、跳躍，呼吸急促、鰓蓋起伏劇烈，體表分泌大量粘液及身體痙攣現象。隨著暴露時間的延長，高濃度組魚的活力減弱，進而腹部朝上，鰓蓋起翹，身體僵硬死亡。Cu中毒死亡個體鰓灰暗，體表及鰓覆蓋銅綠色沉淀；Hg組，胃部膨出，死亡魚腹面皮下充血，呈明顯紅色；As中毒死亡個體背鰭、腹鰭、胸鰭及尾鰭均充血。褐牙鲆急性毒性癥狀見表5。

6種重金屬離子對褐牙鲆的濃度效應關系、半致死濃度(LC50)及95%置信區間見表6所示。對照組中褐牙鲆死亡率均為0，符合急性毒性試驗標準方法的要求。從表6中可以看出，在96 h內，隨著暴露時間延長，重金屬對褐牙鲆的毒性基本呈現增大的趨勢。不同重金屬對褐牙鲆的毒性強度相差很大，由表6可知，重金屬對褐牙鲆的96 h-LC50范圍為0.238～95.137 mg·L-1。以96 h-LC50為依據，6種重金屬離子對褐牙鲆的急性毒性強度：Hg>Cu>Cd>As>Zn>Cr。

表4　重金屬對刺參的急性毒性分析

注：y表示死亡率的概率單位，x表示重金屬離子濃度對數。

Note:y represents the probability unit of death rate, x represents the logarithms of heavy metal concentration.

表5　暴露于重金屬后褐牙鲆急性毒性癥狀

表6　重金屬對褐牙鲆的急性毒性分析

注：y表示死亡率的概率單位，x表示重金屬離子濃度對數。

Note:y represents the probability unit of death rate, x represents the logarithms of heavy metal concentration.

3　討論(Discussion)

3.1重金屬對海水養殖生物的毒性強度評價

3種海水養殖生物對不同重金屬的耐受性具有明顯差異。以96 h-LC50為依據，6種重金屬離子對菲律賓蛤仔的急性毒性大小：Hg>Cu>As>Cd>Zn>Cr；對刺參的急性毒性大小：Hg>Cu>As>Zn>Cd>Cr；對褐牙鲆的急性毒性大小：Hg>Cu>Cd>As>Zn>Cr。對3種生物來講，Hg、Cu毒性最強，其次As、Cd及Zn，Cr毒性則較低。Vieira等[9]在研究重金屬對魚類等水生生物的毒性作用時發現，Hg、Cu對多種水生生物的生長發育均會產生明顯的影響[1, 10-11]。Cao及Peebua等[12-13]報道過Hg對真鯛(Pagrus major)胚胎48 h半致死濃度為0.15 mg·L-1，Cu對尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)仔魚48 h半致死濃度為0.56 mg·L-1，遠低于Cd、Cr等LC50值。李建軍等[14]在研究5種重金屬離子對黑褐新糠蝦的毒性時發現，Cu、Hg對黑褐新糠蝦毒性最大，其安全濃度分別為0.013 mg·L-1、0.015 mg·L-1，遠低于Zn、Pb等離子。Cu在較低濃度下即可對生物體表現出毒性效應，相對于哺乳動物，Cu對水生動物的危害更甚，哺乳動物比魚類、甲殼類動物耐受Cu的劑量高10～100個數量級[5]。Cu會影響水生生物體內Na+/K+-ATP酶的活性，從而導致細胞內外滲透壓失衡[15]，這可能是大多數水生動物對Cu較為敏感的重要原因。Hg對生物體內的類胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等多種活性酶活性均有不同程度的抑制，水體中Hg會誘導生物體內脂質過氧化反應逐步加劇，而丙二醛是脂質過氧化作用產物之一，其含量的增加會嚴重影響水生生物的健康發育[16]。Zn是生物生長的必需元素，少量的Zn在生物細胞和酶的組成、蛋白質及糖代謝過程中有重要作用，但當Zn的量超出一定閾值時會影響生物正常的生理代謝，導致生物生長發育被抑制，對免疫系統和生殖系統也會造成損害[17]。Cd對丙酮酸脫氫酶、硫辛酰胺脫氫酶等多種酶的活性有影響，且由于Cd能取代MT原來螯合的Zn，這可能是Cd對某些海洋生物毒性大于Zn的原因之一[6-7]。Cr對海洋動物的毒性作用往往比其他重金屬弱，這可能與Cr的離子半徑較小及其形態有關[18]。

不同重金屬對養殖生物的毒性存在明顯差異，同一種重金屬對不同養殖生物的毒性差異也不盡相同(表7)。例如表7所示，Cu對褐牙鲆的96 h-LC50大約是菲律賓蛤仔的3倍、刺參的近20倍；Zn對菲律賓蛤仔的96 h-LC50大約是褐牙鲆的1.8倍、刺參的67倍。為了評價外來化合物的急性毒性強弱及對人群的危害程度，國際上提出了化合物的急性毒性分級標準，用以對急性毒性進行評價，但各種分級標準未完全統一。世界衛生組織(WHO)把外來化合物急性毒性分為劇毒、高毒、中等毒、低毒及微毒5級，美國環境保護局規定分為劇毒、高毒、中等毒、低毒4級。參照WHO分級標準，本文提出重金屬離子對3種試驗生物的急性毒性5級分級標準(表8)。從表8中可以看出，Hg、Cu對褐牙鲆和菲律賓蛤仔是中等毒和高毒，而對刺參是劇毒；As、Zn對菲律賓蛤仔和褐牙鲆是低毒，而對刺參是高毒。3種受試生物對6種重金屬耐受性為褐牙鲆>菲律賓蛤仔>刺參。有學者在研究重金屬對養殖生物的急性毒性時發現，Cd對幼刺參及文蛤的96 h-LC50分別為4.64 mg·L-1、13.18 mg·L-1，即對Cd的耐受性為文蛤>幼刺參，與本文研究相符[5,19]。影響重金屬對養殖生物毒性效應的因素很多，受試生物對重金屬耐受性的差異一方面可能是由物種之間的不同引起的，如表9所示，Cd、Zn、Pb等對不同貝類品種96 h-LC50存在顯著差異；另一方面可能與受試生物之間的個體大小以及水溫等因素有關，曹亮[25]曾報道過，Cu對褐牙鲆仔魚的48 h半致死濃度是胚胎的4.2倍，Cd對褐牙鲆仔魚的半致死濃度是胚胎的2.9倍，而Cd對褐牙鲆稚魚的半致死濃度則是胚胎的6.7倍，本實驗褐牙鲆對重金屬的耐受性較高可能與選取的褐牙鲆個體較大有關。孫振興[26]發現在12 ℃水溫條件下，Cd對菲律賓蛤仔的96 h-LC50為11.31 mg·L-1，明顯高于本實驗結果，這可能與本實驗選取的水溫略高(17 ℃)有關，溫度升高會明顯加劇Cd的毒性。

表7　重金屬對3種海水養殖生物的96 h-LC50

表8　重金屬對3種海水養殖生物的急性毒性分級

表9　重金屬對海洋貝類的96 h-LC50

3.2海水養殖安全濃度

按照Marino等[27]推薦的最大容許質量濃度(maximum permissible concentration, MPC)公式：MPC = LC50×0.01，據此計算出本實驗條件下6種重金屬對3種海水養殖生物的安全濃度。由表10可知，現行漁業水質標準完全滿足菲律賓蛤仔和褐牙鲆的養殖用水要求，但本研究發現Cu、Zn、As對刺參的MPC值明顯低于漁業水質標準，這可能與實驗選取的刺參個體較小有關，同時也提醒我們在刺參的養殖生產過程當中，應密切關注養殖用水的重金屬含量變化，以確保養殖生產安全。本研究發現Cd、Cr、Hg等對菲律賓蛤仔和褐牙鲆的MPC值高出漁業水質標準數十倍，說明菲律賓蛤仔和褐牙鲆對重金屬的耐受性較強，在重金屬嚴重超標的情況下仍可能存活。生物(尤其是貝類)對重金屬等毒性物質有很強的蓄積效用，苑旭洲等[28]曾報道過，菲律賓蛤仔對Cd的富集系數高達41.83，隨著人們食品安全意識的提高，水質安全標準不僅要關注養殖水體中毒性物質的濃度大小，還應關注在該質量濃度下養殖生產出的生物的食品安全程度。因此，在生產實際中不能簡單的以養殖生物的成活作為判斷依據，應按照現行水質標準，嚴格控制養殖用海水水質，杜絕在超標海水中進行養殖, 并加強對養殖生物產品中重金屬含量的檢測，以防止重金屬超標。

表10　重金屬對海水養殖生物的最大容許質量濃度

致謝：感謝山東省海洋環境監測中心在重金屬含量檢測上給予的幫助。

通訊作者簡介：姜會超(1984—)，男，海洋生態毒理碩士，助理研究員，主要研究方向為海洋生物學，發表學術論文10余篇。

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Acute Toxicity of Six Heavy Metals on Three Aquaculture Organisms

Qin Huawei, Liu Aiying, Gu Weili, Tao Huimin, Li Jiahui, Li Bin, Sun Shan, Jiang Huichao*

Shandong Institute of Marine Resources and the Environment, Shandong Provincial Key Laboratory of Marine Ecological Restoration, Yantai 264006, China

21 January 2015accepted 3 March 2015

Marine pollution is one of the major issues of global concern. Large quantities of heavy metals enter the aquatic environment via natural and anthropogenic sources every year. Heavy metals in excessive amounts in marine environments may adversely affect the growth, survival, and reproduction of aquatic organisms. The sensitivities of different aquatic organisms to heavy metals are different. Therefore, the exploration of the acute toxicity effects of heavy metals on aquaculture organisms is very important for the sustainable development of aquaculture and risk assessment on marine aquaculture zones. In the present study, the single toxic effects on the Ruditapes philippinarum, Apostichopus japonicus and Paralichthys olivaceus from static exposure to Cd, Cr, Cu, Zn, Hg and As and the difference in acute toxicity of heavy metals for these three aquaculture organisms were studied. The results indicated that the median lethal concentrations (LC50) of acute toxicity of different heavy metals at 96 h to R. philippinarum, A. japonicus and P. olivaceus were 0.134 mg·L-1, 0.0246 mg·L-1, 0.238 mg·L-1for Hg; 0.323 mg·L-1, 0.0499 mg·L-1, 0.975 mg·L-1for Cu; 2.464 mg·L-1, 0.301 mg·L-1, 8.345 mg·L-1for As; 2.843 mg·L-1, 1.111 mg·L-1, 6.787 mg·L-1for Cd; 30.246 mg·L-1, 0.449 mg·L-1, 17.114 mg·L-1for Zn; 32.591 mg·L-1, 2.205 mg·L-1, 95.137 mg·L-1for Cr, respectively. The toxicity of Cd, Cr, Cu, Zn, Hg and As were in the order of Hg>Cu>As>Cd>Zn>Cr for R. philippinarum; Hg>Cu>As>Zn>Cd>Cr for A. japonicus and Hg>Cu>Cd>As>Zn>Cr for P. olivaceus, respectively. In conclusion, Hg and Cu showed the strongest toxicity for R. philippinarum, A. japonicus and P. olivaceus, followed by Cd, As and Zn, while Cr showed the weakest toxicity for these three aquaculture organisms.

heavy metal; Ruditapes philippinarum; Apostichopus japonicus; Paralichthys olivaceus; acute toxicity; LC50

山東省科技發展計劃資助項目(2009GG10009044)；國家自然科學基金青年基金項目(41206094)；山東省自然科學基金青年基金項目(ZR2014DQ018)

秦華偉(1980-)，男，助理研究員，研究方向為海洋生態毒理學，E-mail: weizai1980@126.com

Corresponding author)， E-mail: jianghuichao2008@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150121001

2015-01-21 錄用日期：2015-03-03

1673-5897(2015)6-287-10

X503.225

A

秦華偉, 劉愛英, 谷偉麗, 等. 6種重金屬對3種海水養殖生物的急性毒性效應[J]. 生態毒理學報，2015, 10(6): 287-296

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