大鼠急性缺血性腦卒中雙指數(shù)擴(kuò)散加權(quán)成像研究

張妍，張順，湯翔宇，姚義好，張水霞，石晶晶，覃媛媛，朱文珍

·實(shí)驗(yàn)研究·

大鼠急性缺血性腦卒中雙指數(shù)擴(kuò)散加權(quán)成像研究

張妍，張順，湯翔宇，姚義好，張水霞，石晶晶，覃媛媛，朱文珍

目的：探討大鼠急性缺血性腦卒中MRI及雙指數(shù)擴(kuò)散加權(quán)成像的動態(tài)變化。方法：30只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為大腦中動脈閉塞（MCAO）永久缺血組11只、缺血再灌注組11只及對照組8只，于術(shù)前及術(shù)后0．5、3、6、12和24h分別行單b值、多b值DWI及T2WI掃描，分析表觀擴(kuò)散參數(shù)（ADC）、慢速擴(kuò)散系數(shù)（ADCslow）、快速擴(kuò)散系數(shù)（ADCfast）和快速擴(kuò)散所占容積分?jǐn)?shù)（Afast）的動態(tài)變化，以24hTTC組織染色作為病理對照。結(jié)果：永久缺血組ADC、ADCslow和Afast先降低，6h到達(dá)最低，而后輕度上升；ADCfast缺血后降低，并持續(xù)在一個(gè)較低水平。缺血再灌注組ADC、ADCslow、ADCfast和Afast于再灌注1．5h回升，但仍低于正常水平，而后逐漸下降，至24h到達(dá)最低水平，且此時(shí)與永久缺血組各參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。ADCfast永久缺血組與再灌注組只在3h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），Afast再灌注組與對照組只在3h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論：多b值擴(kuò)散加權(quán)成像可顯示缺血不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)、外水分子的擴(kuò)散受限情況及細(xì)胞內(nèi)、外水分子的轉(zhuǎn)移過程。

卒中；大鼠；擴(kuò)散加權(quán)成像；磁共振成像

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是最常見的卒中類型，缺血組織內(nèi)水分子布朗運(yùn)動減低，受限程度可以通過表觀擴(kuò)散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）值測量。ADC值的降低幾乎與腦細(xì)胞水腫的發(fā)生同步，被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)早期缺血性腦梗死最敏感的參數(shù)，但是ADC值降低的機(jī)理并不十分明確，多數(shù)理論認(rèn)為與水分子在細(xì)胞內(nèi)外的區(qū)域化有關(guān)［1］。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在大b值（b＞1000s／mm2）范圍下，腦活體水分子的信號衰減將偏離單指數(shù)模型，并與快速及慢速擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)，分別對應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外的水分子［2－4］。而在小b值（b＜200s／mm2）范圍則能把微灌注成分從擴(kuò)散中分離出來［5］。本研究利用大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型在大b值范圍內(nèi)進(jìn)行雙指數(shù)擴(kuò)散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）的研究，旨在探討其在急性缺血性腦疾病動態(tài)過程中的意義與價(jià)值。

材料與方法

1．動物模型制作及分組

成年健康雄性Wistar大鼠30只，體重250～300g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。采用線栓法［6］建立右側(cè)MCAO模型，其中永久缺血組11只，缺血再灌注組11只，對照組8只。缺血再灌注模型為缺血1．5h后拔出線栓使血管再通，對照組采用假手術(shù)，僅分離右側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈，不插入線栓；采用腹腔注射10%水合氯醛（劑量3mL／kg）麻醉。

2．MRI檢查與圖像后處理

所有大鼠于術(shù)前進(jìn)行一次基礎(chǔ)MRI掃描，而后于術(shù)后0．5、3、6、12和24h分別進(jìn)行MRI掃描。

MRI檢查采用GE Signal HDxt 3．0T磁共振設(shè)備和晨光公司3．0英寸動物線圈。大鼠取俯臥位，頭先進(jìn)，所有序列行冠狀面連續(xù)掃描7層，層厚2mm，層間距0mm。DWI采用單次激發(fā)平面回波序列（echo planar imaging，EPI），視野5cm×5cm，TR 3100ms，TE 84．4ms，矩陣64×96，激勵(lì)次數(shù)16，掃描時(shí)間為1分42秒。多b值DWI為3個(gè)方向的擴(kuò)散加權(quán)采集，b值取0、20、50、100、200、400、600、800、1000、1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600、4000s／mm2共17個(gè)值，視野10cm×10cm，TR 2000ms，TE 119．8ms，矩陣128×128，激勵(lì)次數(shù)2，掃描時(shí)間為3分18秒。T2WI序列掃描參數(shù)：視野5cm×5cm，TR 1840ms，TE 52．1ms，矩陣192×160，激勵(lì)次數(shù)12，掃描時(shí)間為4分26秒?？倰呙钑r(shí)間小于10min。

采用GE Advantage Windows工作站Functool 4．4volume render軟件，分別在不同時(shí)間點(diǎn)于DWI圖像上逐層勾畫出高信號范圍，由軟件自動計(jì)算高信號灶體積。以24h高信號體積作為本實(shí)驗(yàn)最終梗死區(qū)體積，與TTC染色結(jié)果相對照。采用GE Advantage Windows工作站Functool 4．4軟件包內(nèi)ADC軟件重建出ADC圖，采用同一軟件包內(nèi)MADC軟件，選擇不小于1000s／mm2的9個(gè)b值重建出快速擴(kuò)散系數(shù)（fast apparent diffusion coefficient，ADCfast）圖、慢速擴(kuò)散系數(shù)（slow apparent diffusion coefficient，ADCslow）圖及快速擴(kuò)散所占容積分?jǐn)?shù)（fraction of fast ADC，Afast）圖。雙指數(shù)模型數(shù)學(xué)公式如下：

其中ADCfast和ADCslow分別代表組織的快速和慢速擴(kuò)散，Afast和Aslow分別代表快速和慢速擴(kuò)散所占部分，Afast＋Aslow＝1，b為擴(kuò)散系數(shù)，S（b）是擴(kuò)散系數(shù)為b時(shí)的信號幅度［7］。

興趣區(qū)（region of interest，ROI）選取為缺血中心層面基底節(jié)區(qū)高信號核心（5mm2）及對照組相應(yīng)區(qū)域。

3．病理學(xué)檢查

TTC染色：24h掃描完成后立即處死大鼠，取腦組織置于－20℃冰箱內(nèi)速凍30min取出，與MRI掃描層面對應(yīng)，以冠狀面切2mm厚，置于2%TTC溶液中，37℃水浴30min。此時(shí)正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白色。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18．0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，永久缺血組與再灌注組病灶體積比較采用成組t檢驗(yàn)，三組之間同一時(shí)間點(diǎn)興趣區(qū)間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．大鼠急性腦缺血體積及其與TTC染色的對照分析

24hDWI高信號區(qū)與TTC染色梗死區(qū)體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。永久組24hDWI高信號區(qū)體積大于其它各時(shí)間點(diǎn)。再灌注組3h體積小于其它時(shí)間點(diǎn)，24h體積大于其它時(shí)間點(diǎn)（圖1～3）。再灌注組3、6、12、24h高信號區(qū)體積小于永久缺血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，表1）。

表1 DWI上高信號區(qū)體積及兩組t檢驗(yàn)結(jié)果 （cm3）

2．大鼠急性腦缺血模型的擴(kuò)散參數(shù)演變

永久缺血組：栓塞成功后0．5h可見興趣區(qū)ADC、ADCslow及Afast值下降，6h下降至最低，而后輕度緩慢上升，而ADCfast栓塞成功后即見下降，并持續(xù)在相似水平。

再灌注組：栓塞成功后0．5h可見興趣區(qū)ADC、ADCslow、ADCfast及Afast值下降，再灌注后可見缺血3h時(shí)上升明顯，而后逐漸下降，24h降至最低（圖4）。

3．各組間參數(shù)的單因素方差分析結(jié)果

24h時(shí)永久組與再灌注組各參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；ADCfast永久組與再灌注組只在3h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；Afast再灌注組與對照組只在3h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，表2）。

討 論

Schwarcz等［1］通過液體擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、體外細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腦組織中水分子的擴(kuò)散存在細(xì)胞內(nèi)、外擴(kuò)散的成分。在大b值（b＞1000s／mm2）范圍下，腦活體水分子的信號衰減與快、慢速擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)［2］。Niendorf等［7］推斷，這兩種成分可能分別代表細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)水，其生理基礎(chǔ)是細(xì)胞膜的屏障作用。

圖1 MCAO永久缺血不同時(shí)間點(diǎn)的DWI圖及24hTTC染色圖。永久缺血MCAO大鼠病灶區(qū)DWI信號逐漸增高，面積增大。a）0．5hDWI圖像；b）3hDWI圖像；c）6hDWI圖像；d）12hDWI圖像；e）24hDWI圖像；f）TTC染色圖像。圖2 MCAO永久缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)的DWI圖及24hTTC染色圖。缺血再灌注MCAO大鼠3h病灶面積小于0．5h，隨后面積增大，信號增高，TTC染色與24h病灶大小相仿。a）0．5hDWI圖像；b）3hDWI圖像；c）6hDWI圖像；d）12hDWI圖像；e）24hDWI圖像；f）TTC染色圖像。 圖3 永久缺血MCAO大鼠術(shù)后3hDWI、各擴(kuò)散參數(shù)圖及T2WI圖。a）DWI圖像；b）ADC圖像；c）ADCslow圖像；d）ADCfast圖像；e）Afase圖像；f）T2WI圖像。

表2 三組之間兩兩單因素方差分析結(jié)果（P值）

急性缺血早期，由于血流灌注的下降，細(xì)胞膜功能障礙，水分子內(nèi)流，細(xì)胞水腫，細(xì)胞外間隙縮小，此時(shí)細(xì)胞外水分子（快擴(kuò)散）比例減少，細(xì)胞內(nèi)水分子（慢擴(kuò)散）比例增多。病理學(xué)研究表明，大鼠MCAO后0．5h缺血側(cè)尾狀核出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞輕度水腫，1h細(xì)胞水腫加重，2h出現(xiàn)間質(zhì)水腫，3h出現(xiàn)核固縮，間質(zhì)水腫加重，6h出現(xiàn)細(xì)胞的局灶性壞死，24h出現(xiàn)廣泛壞死灶［8］。同時(shí)，缺血3h后血腦屏障即被破壞，形成血管源性水腫［］。

本實(shí)驗(yàn)得到一組大鼠急性缺血性梗死時(shí)的擴(kuò)散參數(shù)，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，ADC值、ADCslow、ADCslow與Afast均下降，與以往大鼠及人的急性缺血性梗死表現(xiàn)一致［1，10，11］。通過病理生理學(xué)研究得知，缺血發(fā)生后1h內(nèi)以細(xì)胞毒性水腫為主，細(xì)胞內(nèi)水分子增多，ADCslow下降提示細(xì)胞內(nèi)分子擴(kuò)散受限，此時(shí)細(xì)胞外間隙縮小，細(xì)胞外擴(kuò)散同時(shí)受限，ADCfast下降。Afast由于水分子內(nèi)流、細(xì)胞外水分子所占比例減少而下降。缺血3～12h細(xì)胞毒性水腫加重，并開始出現(xiàn)血管源性水腫，細(xì)胞內(nèi)水分子運(yùn)動更加困難，ADCslow持續(xù)下降，水分子繼續(xù)自細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，Afast同時(shí)下降；但ADCfast沒有太大改變，認(rèn)為與血腦屏障破壞，血管內(nèi)水分子滲漏使得細(xì)胞外間隙增寬有關(guān)。缺血12～24h細(xì)胞毒性及血管源性水腫并存，并有大量細(xì)胞溶解，破裂的細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)水分子擴(kuò)散受限得以緩解，ADCslow上升，Afast上升但仍低于正常水平；ADCfast不變可能與同時(shí)存在裂解碎片對水分子運(yùn)動的阻礙有關(guān)［12］，與大鼠凍傷致細(xì)胞溶解所得到的結(jié)果一致［13］，但此時(shí)梗死區(qū)依然存在完整腫脹的細(xì)胞，使得本研究結(jié)果更加復(fù)雜。再灌注組所有參數(shù)于再灌注1．5h有所上升，隨后下降并接近永久組水平，被認(rèn)為與缺血再灌注損傷有關(guān)。雖然血流灌注的恢復(fù)使得細(xì)胞水腫得以緩解，短時(shí)間內(nèi)似可看到正常表現(xiàn)，但此時(shí)缺血級連反應(yīng)已經(jīng)啟動，引起遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞壞死［14，15］，同時(shí)血腦屏障已受到破壞，血管源性水腫已經(jīng)存在［16］。

圖4 大鼠急性腦缺血模型的擴(kuò)散參數(shù)隨時(shí)間的演變。

實(shí)際上快、慢速擴(kuò)散至少有兩種典型的情況，即細(xì)胞內(nèi)、外水分子及血管內(nèi)（快擴(kuò)散，即灌注）、外水分子（慢擴(kuò)散）。MRI測得的擴(kuò)散很容易被微循環(huán)灌注所污染［16］。后處理時(shí)采用不同b值范圍影響不同區(qū)域水分子擴(kuò)散的權(quán)重，b值越小，所包含的水分子微循環(huán)灌注因素就越大。在b值＜200s／mm2時(shí)，灌注成分可能占據(jù)不可忽略的比例［17］，因此單用小b值得出的參數(shù)可以一定程度代表微灌注水平，并可利用此灌注參數(shù)研究肝硬化、前列腺腫瘤等疾?。?8，19］。MCAO再灌注過程中，血流水平會有很大的上升，本組研究中，后處理時(shí)將b值＜200s／mm2的包含灌注成分的快速擴(kuò)散成分舍棄，并選用了更符合雙指數(shù)衰減的b值（＞1000s／mm2），因而可以更準(zhǔn)確地探討細(xì)胞內(nèi)、外水分子的運(yùn)動。當(dāng)然，因?yàn)檠鞴嘧⒌淖兓谀X缺血疾病中起到至關(guān)重要的作用，下一步我們將更加關(guān)注小b值所得到的微灌注參數(shù)。

綜上所述，ADC是診斷AIS的敏感指標(biāo)。AIS的動態(tài)變化比較復(fù)雜，雙指數(shù)模型多b值DWI可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)、外水分子擴(kuò)散受限情況及細(xì)胞內(nèi)、外水分子的轉(zhuǎn)移，對缺血等擴(kuò)散受限性疾病的進(jìn)展過程及治療將提供一定的指導(dǎo)和幫助。

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Study of biexponential diffusion weighted imaging in acute brain ischemia of rats

ZHANG Yan，ZHANG Shun，TANG Xiang－yu，et al．Department of Radiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，P．R．China

Objective：To explore the dynamic changes of MRI and biexponential diffusion weighted imaging in acute brain ischemia of rats．Methods：30mature male Wistar rats were divided into control group（n＝8）and middle cerebral artery occlusion（MCAO）group（n＝22）randomly．The MCAO group was further divided into permanent ischemia group（n＝11）and ischemia－reperfusion group（n＝11）．All 30rats underwent single－b value DWI，multi－b value DWI and T2WI scanning，which were performed before and 0．5h，3h，6h，12hand 24hafter surgery operation．The dynamic changes of apparent diffusion coefficient（ADC），slow apparent diffusion coefficient（ADCslow），fast apparent diffusion coefficient（ADCfast）and fraction of fast ADC（Afast）were analyzed，TTC tissue staining with 24hours was used as pathology correlation．Results：In permanent ischemia group，the ADC，ADCslowand Afastdecreased firstly and reached to the lowest value at 6h，then increased slightly．ADCfastdecreased after ischemia and maintained at a relatively low level．In ischemia－reperfusion group，the ADC，ADCslow，ADCfastand Afastdecreased after the occlusion，then increased after 1．5hof the reperfusion，but still lower than normal level，then decreased gradually to the lowest level at 24h．There was no statistical difference in ADC，ADCslow，ADCfastand Afastbetween permanent ischemia group and ischemia－reperfusion group at 24h（P＞0．05）．There was statistical difference in ADCfastbetween permanent ischemia group and ischemia－reperfusion group only at the time－point as 3h（P＜0．05）．There was no statistical difference in Afastbetween control group and ischemia－reperfusion group only at 3h time－point（P＞0．05）．Conclusion：Multi－b value DWI can display the diffusion－limited status and transfer process of water between intra and extracellular at different time points of ischemia．

Stroke；Rats；Diffusion weighted imaging；Magnetic resonance imaging

R743．3；R445．2

A

1000－0313（2015）01－0012－04

10．13609／j．cnki．1000－0313．2015．01．004

2014－08－01

2014－11－24）

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院放射科

張妍（1987－），女，河南南陽人，碩士研究生，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)影像診斷工作。

朱文珍，E－mail：zhuwenzhen＠hotmail．com

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI08B10）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NO．81171308）