分步酶解法制備黃漿水活性肽

劉麗莎，彭義交，任　麗，田　旭，白　潔，呂曉蓮，陶國琴，郭　宏*

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京100162；2.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京100053）

分步酶解法制備黃漿水活性肽

劉麗莎1，彭義交1，任麗1，田旭1，白潔1，呂曉蓮2，陶國琴1，郭宏1*

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京100162；2.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京100053）

黃漿水是傳統(tǒng)豆制品點腦成型過程壓榨出的廢棄物，富含低聚糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分。該研究通過比較酶種類及用量、酶解溫度、酶解時間對黃漿水蛋白質(zhì)水解度的影響，采用正交試驗優(yōu)化獲得黃漿水短肽最佳分步酶解工藝：（1）酸性蛋白酶加酶量2 000 U/g，pH 4.0，溫度55℃，水解2 h；（2）中性蛋白酶8 000 U/g，pH 6.0，溫度50℃，水解6 h。在此條件下進(jìn)行驗證，水解度可達(dá)25.95%，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶體外抑制活性達(dá)92.0%。采用酸性蛋白酶和中性蛋白酶分步酶解黃漿水制備短肽，制備條件溫和，水解度高，可為豆制品加工廢棄物的高值化利用奠定基礎(chǔ)。

黃漿水；分步酶解；短肽；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性

豆腐、腐乳、豆干等是我國傳統(tǒng)豆制品，距今已有千余年歷史。傳統(tǒng)豆制品在壓榨過程中每加工1 t大豆需排放2～5 t黃漿水（乳清廢水）［1］，含0.4%～0.5%乳清蛋白，1%～2%總糖，生物耗氧量（biochemical oxygen demand，BOD）達(dá)10 000 mg/L［2］，由于目前大部分豆制品加工企業(yè)規(guī)模小、設(shè)備水平低，對黃漿水的功能成分回收及環(huán)境污染問題不夠重視，僅作為廢棄物排放，給企業(yè)和環(huán)境造成極大負(fù)擔(dān)。研究人員針對黃漿水綜合利用開展了一些工作，利用超濾、生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)低聚糖、細(xì)菌纖維素［3］、γ-氨基丁酸［4］、L-乳酸［5］和維生素B12［6］等活性成分，但仍處于初步摸索階段，對于利用黃漿水蛋白質(zhì)生產(chǎn)活性肽的研究鮮見報道。

研究證實，大豆肽具有降血壓［7-8］、抗氧化［9-10］、免疫調(diào)節(jié)［11］等生理活性，利用大豆分離蛋白制備大豆肽已成功應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。黃漿水蛋白質(zhì)較大豆分離蛋白而言分子質(zhì)量較小、水溶性高，更易制備小分子肽。現(xiàn)有大豆肽生產(chǎn)工藝多采用堿性蛋白酶或中性蛋白酶制備，由于黃漿水pH較低（pH 4.5～4.7），堿性蛋白酶酶解工藝會引入大量離子，增加脫鹽工序難度，不適宜用于黃漿水蛋白質(zhì)酶解。本研究從適合黃漿水水解的蛋白酶種類出發(fā)，采用分步酶解工藝制備黃漿水活性肽，為豆制品加工過程中廢棄物的綜合利用提供新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃漿水（經(jīng)超濾、反滲透濃縮，蛋白含量5%）：北京二商希杰食品有限責(zé)任公司。

酸性蛋白酶（55 000 U/g）：南京奧多福尼生物科技有限公司；中性蛋白酶：泰安信得利生物工程有限公司（150000U/g）、南寧龐博生物工程有限公司（203 000 U/g）、合肥博美生物科技有限責(zé)任公司（121 000 U/g）；木瓜蛋白酶（papain）（208 000 U/g）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（alcalase）（202000U/g）、復(fù)合蛋白酶（pro-tamex）（225000U/g）、風(fēng)味酶（24000U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

N-［3-（2-呋喃基）丙烯酰］-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-［3-（2-furylacryloyl）］-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）：美國Sigma-Aldrich公司；甲醛、氫氧化鈉等（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

PHS-25型酸度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL104電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；H1多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蛋白酶篩選

在濃縮黃漿水中分別添加3 000 U/g的蛋白酶，在其各自適宜的溫度、pH值條件下水解1 h，分別測定酶解液水解度（degree of hydrolysis，DH）。

1.3.2黃漿水蛋白質(zhì)酶解工藝研究

酸性蛋白酶單因素酶解試驗：推薦的酸性蛋白酶作用條件為酶用量3 000 U/g底物，反應(yīng)溫度45℃，酶解時間2 h。改變其中單一因素，分別考察酶用量、反應(yīng)溫度、pH值及酶解時間對DH的影響，各因素水平分別為酶用量（1 000 U/g、2 000 U/g、3 000 U/g、4 000 U/g、5 000 U/g）；pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）；溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）；酶解時間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h）。

中性蛋白酶單因素酶解試驗：以推薦的中性蛋白酶（酶用量5 000 U/g，反應(yīng)溫度55℃，pH 7.0，反應(yīng)時間4 h）為基礎(chǔ)，分別考察酶用量、反應(yīng)溫度、pH值及酶解時間對DH的影響，各因素水平分別為酶用量（3 000 U/g底物、5 000 U/g底物、7 000 U/g底物、9 000 U/g底物、11 000 U/g底物）；pH值（5、6、7、8）；溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）；酶解時間（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h）。

分步酶解正交試驗：黃漿水經(jīng)酸性蛋白酶在最適條件下水解2 h，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定影響黃漿水酶解的主要因素，以中性蛋白酶的酶解時間、加酶量、pH值、酶解溫度進(jìn)行正交試驗L9（34），以DH為指標(biāo)確定最佳酶解工藝參數(shù)。

表1　黃漿水蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for soybean whey protein hydrolysis condition optimization

1.3.3水解度測定［12-13］

采用甲醛滴定法測定水解液中氨基酸含量，計算水解度，水解度計算公式如下：

式中：N0為底物游離氨基酸含量，%；Nh為水解液中氨基酸含量，%；N總為底物中的總蛋白質(zhì)含量，%。

1.3.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳［14］

分別配制5%濃縮膠和12%分離膠，樣品按1∶4與上樣緩沖液混合，上樣量20 μL，電泳完畢后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色后于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

1.3.5ACE抑制活性［15］

在比色杯中加入1 mL 0.5 mmol/L的FAPGG（溶解于50mmol/LTris-HCl緩沖液，含0.3mol/LNaCl，pH7.5），20μL ACE（1 U/mL），200 μL樣品，室溫條件下混勻，于2 min內(nèi)在波長345 nm處測定吸光度值的降低速率。樣品為黃漿水酶解液經(jīng)5 000 μ超濾膜濾出液，空白以Tris-HCl緩沖液代替樣品。根據(jù)下列公式計算ACE抑制活性：

式中：ΔA為1 min內(nèi)吸光度值的變化。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶篩選

8種不同蛋白酶在推薦使用條件下水解能力如圖1所示。

圖1　不同蛋白酶對水解度的影響Fig.1 Effect of different protease on hydrolysis degree

由圖1可知，中性蛋白酶（信得利）酶解效果最佳，水解1 h后水解度達(dá)6.56%。研究表明，相對分子質(zhì)量較小（＜1 500 u）的ACE抑制肽效果較佳。在酶解過程中，利用不同種類蛋白酶酶切位點不同，采用分步酶解，可提高酶解液水解度，更易制備分子質(zhì)量較小的活性肽。由于黃漿水在制作、儲運過程中常會污染乳酸乳球菌［16］、嗜酸乳桿菌［17］等產(chǎn)酸菌，導(dǎo)致黃漿水pH值為4.3～4.5，且其中含有大量的鈣、鎂離子，在堿性條件下易產(chǎn)生沉淀，因此，選用水解效果較佳的酸性蛋白酶和中性蛋白酶（倍得利）復(fù)合酶解黃漿水蛋白質(zhì)，盡可能減少后期脫鹽難度。

2.2酸性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

酸性蛋白酶酶解黃漿水蛋白的單因素試驗結(jié)果見圖2。

圖2　酸性蛋白酶酶解時間（A）、溫度（B）、pH值（C）、加酶量（D）對水解度的影響Fig.2 Effect of acid protease hydrolysis time（A），temperature（B），pH（C）and addition（D）on hydrolysis degree

由圖2A可知，酸性蛋白酶在前2 h內(nèi)，水解速度較快，隨后DH上升緩慢。隨著酶解時間延長，大分子蛋白質(zhì)在水解成小分子肽的過程中，酶切位點逐漸減少，使得DH增長趨勢趨于平緩。因此選擇酶解時間2 h為宜；由圖2B可知，水解度隨酶解溫度升高而緩慢上升，55℃時水解度最高，溫度較高時，分子運動加快，酶與底物碰撞機率變大從而提高酶的催化效率［18］，因此選擇酶解溫度55℃為宜；由圖2C可知，水解度隨酶解pH值上升呈先上升后下降的趨勢，在酶解pH值為4.0時水解度最高，因此酸性蛋白酶最適水解pH值為4.0為宜。由圖2D可知，加酶量達(dá)2000U/g底物后，加酶量增加對水解度的影響趨于平穩(wěn)，因此選擇加酶量2 000 U/g為宜。綜上確定酸性蛋白酶水解條件為加酶量2 000 U/g，pH 4.0，溫度55℃，酶解時間2 h。

2.3中性蛋白酶酶解條件優(yōu)化

2.3.1單因素試驗

中性蛋白酶酶解單因素試驗結(jié)果見圖3。

圖3　中性蛋白酶酶解時間（A）、溫度（B）、pH值（C）、加酶量（D）對水解度的影響Fig.3 Effect of neutral protease hydrolysis time（A），temperature（B），pH（C）and addition（D）on hydrolysis degree

由圖3A可知，中性蛋白酶水解度隨酶解時間延長逐漸增大，到4 h增長速率變緩，到6 h后趨于穩(wěn)定，因此選擇酶解時間4～6 h進(jìn)行正交試驗。由圖3B可知，中性蛋白酶在45～60℃條件下水解活性較強，其中50℃時DH最高，在40℃時酶的水解能力較差，可能與體系內(nèi)分子運動激烈程度有關(guān)，蛋白酶與底物碰撞機率較小所致，溫度超過50℃時，酶分子構(gòu)象可能受影響，喪失部分催化能力，因此選擇酶解溫度45～55℃進(jìn)行正交試驗。由圖3C可知，中性蛋白酶水解度隨酶解pH值升高呈先緩慢上升后下降的趨勢，pH值為6.0時水解度達(dá)最大值，因此選擇中性蛋白酶酶解pH值5.5～6.5進(jìn)行正交試驗。由圖3D可知，中性蛋白酶水解度隨加酶量的增加呈現(xiàn)先上升后變化趨于平緩的趨勢，加酶量＞7 000 U/g底物后，加酶量繼續(xù)增加對水解度的影響較小，因此選擇加酶量為6 000～8 000 U/g底物進(jìn)行正交試驗。

2.3.2正交試驗優(yōu)化

黃漿水中性蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表2　黃漿水蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for soybean whey protein hydrolysis condition optimization

由表2可知，各因素影響主次關(guān)系為B（加酶量）＞D（酶解溫度）＞A（酶解時間）＞C（pH值），最佳酶解組合為A3B3C2D2，即中性蛋白酶加酶量8 000 U/g，pH 6.0，溫度50℃，水解6 h。在此條件下進(jìn)行驗證，水解度可達(dá)25.95%。

2.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳

黃漿水酶解液SDS-PAGE電泳圖見圖4。

由圖4可知，酶解前，蛋白集中于50 ku、30 ku、10 ku，呈彌散態(tài)，由于豆腐制作需浸泡10 h以上，大豆處于萌芽早期，內(nèi)源蛋白酶開始水解蛋白［19］，且在豆腐制作及黃漿水儲運過程中，微生物的分解也會造成蛋白降解。經(jīng)酸性蛋白酶酶解后，50 ku、30 ku處蛋白條帶消失，僅在10 ku附近有少量條帶，說明大分子蛋白被水解成小分子蛋白。經(jīng)分步酶解后，蛋白條帶徹底消失，經(jīng)酸性蛋白酶和中性蛋白酶共同作用，水解程度增加，小分子肽的分子質(zhì)量分布將在后續(xù)研究中通過層析分離、液相色譜進(jìn)一步探究。

圖4　黃漿水酶解液SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretogram of soybean whey hydrolysate

2.5酶解液ACE抑制活性

ACE抑制活性能在一定程度上預(yù)測降血壓活性，通過Holmquist法測得酶解后黃漿水ACE抑制活性變化如表3所示。

表3　酶解液的ACE體外抑制活性Table 3in vitroACE inhibitory activity of hydrolysate

從表3可知，黃漿水酶解前后均對ACE表現(xiàn)出一定活性，酶解前抑制率為22.7%，酶解后抑制率升高為92%（P＜0.01）。由于黃漿水采用5 000 ku超濾膜濃縮，濃縮液中可能存在少量小分子肽等活性成分，對ACE活性有一定的抑制作用，當(dāng)分步酶解后，大分子蛋白進(jìn)一步降解成小分子肽，大幅提高ACE抑制活性，高達(dá)90%以上，較劉佳等［20-21］制備的大豆活性肽高。

3　結(jié)論

本研究通過單因素試驗確定酸性蛋白酶及中性蛋白酶水解黃漿水蛋白作用條件，通過正交試驗優(yōu)化確定了黃漿水蛋白分步酶解工藝：（1）酸性蛋白酶加酶量2 000 U/g，pH 4.0，溫度55℃，酶解時間2 h；（2）中性蛋白酶8 000 U/g，pH 6.0，溫度50℃，酶解時間6 h，水解度可達(dá)25.95%，ACE體外抑制活性達(dá)92.0%。降血壓肽是一類具有降血壓活性的多肽物質(zhì)，目前許多研究已表明大豆活性肽具有多種良好的生物活性［22-25］，黃漿水作為豆制品加工過程中產(chǎn)生的大量廢棄物，含有豐富的蛋白質(zhì)，且較大豆蛋白而言，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較小，更易獲得分子質(zhì)量較小的多肽。經(jīng)研究驗證，本研究所采用的分步酶解法制備的活性肽具有極強的ACE抑制活性，在后續(xù)研究過程中，將對其中的活性多肽組分開展研究，為開發(fā)有市場潛力的多肽類降血壓藥物和營養(yǎng)素提供思路，也為豆制品加工企業(yè)解決治污難題開辟一個新的途徑。

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Preparation of oligopeptides from soybean whey by stepwise enzymatic hydrolysis

LIU Lisha1，PENG Yijiao1，REN Li1，TIAN Xu1，BAI Jie1，LV Xiaolian2，TAO Guoqin1，GUO Hong1*
（1.Beijing Academy of Food Sciences，Beijing 100162，China；2.Beijing Er Shang Group Co.，Ltd.，Beijing 100053，China）

The soybean whey from tofu processing was the waste water，which contains protein and soy oligosacharides.In this study，the effect of enzyme variety，enzyme addition，hydrolysis temperature，time and pH on the hydrolysis degree of soybean whey protein were studied.The optimum stepwise enzymatic hydrolysis conditions for the preparation of oligopeptides from soybean whey were determined by orthogonal experiment:（1）acid protease addition 2 000 U/g，pH 4.0，55℃for 2 h.（2）Neutral protease addition 8 000 U/g，pH 6.0，50℃for 6 h.Under these conditions，the hydrolysis degree reached 25.95%，in vitroinhibitory activity of angiotensin converting enzyme was 92.0%.Using acid protease and neutral protease to prepare oligopeptide by stepwise enzymatic hydrolysis，the preparing condition was mild，and the hydrolysis degree was high，which could lay a foundation for comprehensive utilization of soybean product processing waste.

soybean whey；stepwise proteinase hydrolysis；oligopeptide；ACE inhibitory activity

TS214.2

A

0254-5071（2015）10-0013-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.004

2015-09-14

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”計劃（2013AA102105）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助（2014754154700G201）

劉麗莎（1989-），女，工程師，碩士，研究方向為食品微生物及天然活性成分研究。

郭宏（1961-），男，教授級高級工程師，碩士，研究方向為豆制品加工及綜合利用。