一株轉化阿魏酸產香蘭素菌株的篩選與鑒定

嚴曉娟，宋勇強*，牛　犇，胡先望

（甘肅省商業科技研究所，甘肅蘭州730010）

一株轉化阿魏酸產香蘭素菌株的篩選與鑒定

嚴曉娟，宋勇強*，牛犇，胡先望

（甘肅省商業科技研究所，甘肅蘭州730010）

采用梯度稀釋平板分離法從土壤中分離菌種，并通過與研究中心實驗室購買和保存的其他11株菌株進行比較，最終篩選出了一株香蘭素摩爾轉化率和轉化效率相對較高的菌株B7，結合菌株形態學特征、生理生化試驗結果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統發育分析結果，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

阿魏酸；香蘭素；篩選；鑒定

香蘭素（vanillin）又名香草醛、香草素、香蘭醛或香茅醛、甲基原兒茶醛、凡尼林［1］。化學名稱4-羥基-3-甲氧基苯甲醛。香蘭素具有香莢蘭豆的香氣，白色至黃色針狀或粉末狀結晶，微溶于水（1 g/100 mL，20℃），易溶于乙醇、苯甲基苯甲酸酯、冰醋酸、二硫化碳、吡啶、脂肪和芳香酯等有機溶劑和強堿溶液中。易受光化作用的影響，在空氣中逐漸氧化。香蘭素具有較低的氣味識別閾值，在生產和儲存過程中容易攜帶其他氣味［2-3］。無毒、對人和動物無害，對皮膚和黏膜有局部的刺激［4］。香蘭素是一種具有代表性的廣譜香料，有“香料之王”的美稱，也是重要的有機化學品中間體，在食品工業、醫藥工業、日化工業、煙草工業、電鍍工業等領域得到了廣泛的應用［5］。

香蘭素是目前世界上產量最大的合成香料，需求量逐年遞增。目前，市場上供應的香蘭素有三種來源，即：（1）從香子蘭花莢中提取的天然香蘭素；（2）用化學合成法（如愈創木酚法、木質素法、黃樟素法等）生產的香蘭素［6-8］；（3）用微生物法生產的香蘭素［9-11］。化學方法生產香蘭素產率高，處于香蘭素合成主導地位。但是大多數化學合成的香蘭素在純度、香氣、安全性等方面都低于天然提取的香蘭素，并且化學工藝產生的廢棄物污染環境。微生物轉化法生產天然香蘭素，在生產過程中轉化率較高，生產成本較低，清潔環保，產品安全［12］。隨著現代生物學的發展，微生物轉化法生產天然香蘭素逐漸成為研究焦點［13-14］。

目前，能夠利用阿魏酸為底物生產香蘭素的菌株有枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、鏈霉菌（Streptomycetaceae）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、擬無枝酸菌（Amycolatopsis）、食醋叢毛單胞菌（Pseudomonas acidovrans）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）等，其中擬無枝酸菌（Amycolatopsis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）能夠將底物阿魏酸轉化生成較高產量的香蘭素［15］。為降低生產成本，近些年，采用基因工程手段或誘變育種選育高產菌株可以降低生產成本，提高轉化率。

本研究從化妝品廠排污口處深層土壤中篩選分離出了5株可以轉化阿魏酸產生產香蘭素的菌株，通過初篩、復篩并和實驗室其他購買和保藏的供試菌株進行對比之后，得到一株轉化阿魏酸產香蘭素效率較高且高產香蘭素的菌株B7，通過形態學、生理生化試驗及16S rRNA序列方法對所獲得菌株進行鑒定，為工業化生物法合成香蘭素提供新的菌種資源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

分離樣品取自甘肅省某化妝品廠排污口處深層土壤；部分試驗菌種來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC）、中國農業微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（Guangdong institute of microbiology ofmicrobialculturecollectioncenter，GIM）、甘肅省商業科技研究所（Gansu Institute of Business and Technology，GIBT）保藏的菌株。

1.1.2培養基

平板分離培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，1.0 g/L阿魏酸，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

富集培養基：15 g/L淀粉，0.3 g/L氯化鈉，0.5 g/L硝酸鉀，0.01 g/L七水硫酸亞鐵，0.3 g/L磷酸氫二鉀，0.3 g/L七水硫酸鎂。

純化培養基：20g/L瓊脂粉，15g/L淀粉，0.3g/L氯化鈉，0.5 g/L硝酸鉀，0.01 g/L七水硫酸亞鐵，0.3 g/L磷酸氫二鉀，0.3 g/L七水硫酸鎂。

初篩培養基：1 g/L阿魏酸，蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0。

種子培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH 7.0。

梯度誘導馴化培養基：配制阿魏酸質量濃度分別為0.2 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L、2.0 g/L的種子培養基。

營養肉汁培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，自然pH，將馬鈴薯洗凈去皮，切片后稱取200.0 g，加水煮沸30 min，用紗布過濾后，加入葡萄糖和瓊脂補足至1.0 L。充分加熱溶解分裝，121℃滅菌20 min。

1.1.3試劑

無水葡萄糖：天津市致遠化學試劑有限公司；酵母膏：北京雙旋微生物培養基制品廠；牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉：天津市大茂化學試劑廠；氯化鈉：南京化學試劑有限公司；硫酸鎂：成都化學試劑廠；磷酸氫二鉀：西安化學試劑廠；阿魏酸：2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）：上海中秦化學試劑有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；瓊脂粉：北京索萊寶科技有限公司；香蘭素：天津市天新精細化工開發中心；以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

Mettler ToledoAL204分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZM型立式智能壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HWS-150型恒溫恒濕培養箱、DZG-6050型真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器：江蘇常州市國立試驗設備研究所；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-1800PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M湘儀離心機：長沙高新技術產業開發區湘儀離心機有限公司；PHS-3C型酸度計：上海佑科儀器儀表有限公司；Eppendorf移液槍：德國艾本德股份公司；THZ-82N臺式恒溫振蕩器培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；2720 Thermal CyclerPCR儀：美國ABI公司；DYY-5型穩壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1產香蘭素菌種的分離

稱取10 g土壤置于250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水，搖勻。取混合后溶液的上清液，梯度稀釋獲得最終濃度分別為10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL的菌懸液。從中任意選取3個稀釋度，用無菌移液槍準確吸取1 mL梯度稀釋液于干凈無菌的培養皿中，并且每一個稀釋梯度做2個平行，然后將溫度冷卻至45℃左右的平板分離培養基溶液倒入無菌培養皿中，每個培養皿倒入12～15 mL，搖勻，待培養皿中的瓊脂培養基凝固后，在恒溫恒濕培養箱中30℃倒置培養48 h。

1.3.2香蘭素的定性［16-18］

香蘭素的定性檢測采用薄層色譜法：將待測菌株發酵液、香蘭素標準溶液、阿魏酸標準溶液分別用管口平整的毛細管滴加于薄層板一端約1 cm處的起點線上，置薄層板于盛有展開劑的展開槽內，浸入深度為0.5 cm，待展開劑前沿離原點約8cm處時，將色譜板取出，干燥后在波長254 nm的紫外照射燈下觀察熒光條帶。薄層層析展開劑為乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）。若展開的發酵液條帶中出現和香蘭素標準液條帶上紫色熒光點位置相同（即具有相同比移值Rf）的熒光點，則說明該菌株能夠轉化阿魏酸產生香蘭素。

1.3.3菌種初篩

將平板分離得到的菌株分別接種到初篩培養基中，置于恒溫振蕩器上150 r/min、30℃振蕩培養24 h后，取各菌株發酵液，采用1.3.2中香蘭素定性方法并根據薄層色譜試驗結果淘汰部分不轉化阿魏酸產香蘭素的菌株。

1.3.4香蘭素標準曲線的制作

20∶1鹽酸溶液（V/V）配制：精確量取濃鹽酸10.0 mL，加入去離子水200 mL，混勻后備用。

0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液：準確稱取2-硫代巴比妥酸0.5 g，加入少量無水乙醇溶解，轉移至100 mL容量瓶定容。

香蘭素標準曲線的制作：精確稱取香蘭素0.02 g，用蒸餾水溶解，轉移至100 mL容量瓶中定容作為母液。將母液稀釋配制成20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L梯度濃度香蘭素溶液。取11支25 mL比色管，按表2混合溶液，待定容后，振蕩搖勻，于55℃水浴保溫10 min。然后于室溫放置20 min，在波長440 nm處測定吸光度值，繪制香蘭素標準曲線。

1.3.5菌種復篩

將經過初篩得到的各菌種活化后分別接種于種子培養基中，置于恒溫振蕩器上150r/min、30℃培養24h后，再加入10mL底物質量濃度為1g/L的阿魏酸溶液繼續培養24h。培養結束后，測定各菌株發酵液中的香蘭素含量（mg/L），通過比較其發酵液中的香蘭素含量的高低進行復篩。

1.3.6供試菌株

其他供試菌株為在各菌種保藏機構所購買及本研究實驗室保藏菌種見表1。

表1　用于篩選試驗的保藏菌種信息Table 1 The information of preserved strains for screening tests

1.3.7菌株轉化香蘭素能力測定

取試管加入5mL20∶1（V/V）的鹽酸溶液、2mL質量分數為0.5%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液、1mL發酵液，2mL蒸餾水。搖勻，于55℃水浴保溫10 min，立即使用冷卻水沖洗管外壁終止反應，室溫放置20min，在波長440nm處測定吸光度值，以加入阿魏酸不含菌液的液體培養基作為參比，測定吸光度值。按照香蘭素標準曲線回歸方程計算發酵液中香蘭素含量，香蘭素摩爾轉化率和轉化效率的計算公式如下：

1.3.8生長量的測定

以加入阿魏酸不含菌液的液體培養基作為參比，在波長660 nm處測定菌株發酵液的吸光度值。

1.3.9形態及生理生化鑒定

將分離篩選得到的轉化阿魏酸產香蘭素的菌株依據東秀珠等主編的《常見細菌系統鑒定手冊》［19］和《伯杰細菌鑒定手冊（第八版）》［20］進行初步鑒定。

1.3.10菌株16S RNA序列鑒定及系統發育樹構建［21］

挑取純化后的菌株B7的單菌落接種于裝有10 mL發酵培養基的三角瓶中，放入恒溫振蕩培養箱中，在溫度30℃、轉速150r/min的條件下振蕩培養24h。用移液槍準確的吸取2 mL菌液，在低溫高速冷凍離心機中以12 000 r/min離心2 min后，去除上清液，再按照生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書的試驗步驟提取菌株的基因組DNA，作為模板。

首先進行16SrDNA的擴增，采用引物（上游：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'；下游：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'），建立聚合酶鏈反應（polymerse chain reaction，PCR）體系（25 μL）：上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；Template（基因組）1 μL；脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL；Taq（5 U/μL）0.2 μL；10×反應緩沖液2.5 μL；最后加水補充至25 μL。

設定PCR程序：在94℃預變性5 min后進入循環程序：94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，共計35個循環，最后在72℃保溫8 min。

精密吸取50 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據PCR產物電泳結果切割所需DNA目的條帶，純化以后進行后續DNA的測序工作，將提取的基因組DNA委托上海生工生物工程有限公司進行16S rDNA基因擴增序列測序。在GenBank數據庫中提交測序結果，通過BLAST程序提交得到的16S rRNA序列，最后在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）在線數據庫中進行同源序列檢索。將目標菌株的16S rDNA和在BLAST程序中檢索到的與之有較高同源性的模式菌株的16SrDNA作最大同源性比較分析，并利用系統發育軟件MEGA 4.0采用鄰位相鄰法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，同時進行重復次數為1 000次的Bootstrap測試，最終確定目標菌株的分類地位。

2　結果與分析

2.1香蘭素含量標準曲線

以香蘭素含量（x，mg/L）為橫坐標、OD440nm（y）為縱坐標繪制香蘭素標準曲線，結果見圖1。

圖1　香蘭素標準曲線Fig.1 Standard curve of vanillin

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=0.001 1x-0.000 2，相關系數R2=0.998 7。表明香蘭素含量與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2菌種篩選結果

本實驗通過初篩在土壤中得到14株菌落B3～B16，并通過添加底物阿魏酸發酵進行復篩，從中篩選純化出5株能夠轉化阿魏酸生產香蘭素的菌株B5、B7、B11、B14、B15，比較其摩爾轉化率，結果如圖2所示。

圖2　五株菌株香蘭素轉化能力比較Fig.2 The comparison of conversion capability of vanillin among five strains

由圖2可知，菌株B5、B11、B15的摩爾轉化率均＜10%，只有菌株B7和B14的摩爾轉化率＞10%，且菌株B7的摩爾轉化率最高，達到了29.01%。從轉化效率的結果看，菌株B7（49.66%）和B14（32.3%）的轉化效率均高于其余3株菌株，菌株B7的轉化效率是5株菌株中最高的，所以選取B7作為供試菌株進行后續試驗研究。

2.3不同菌種轉化阿魏酸產香蘭素能力的比較

將篩選得到的菌株B7和研究中心實驗室購買和保藏的其他11株菌種分別接種于種子培養基中，置于恒溫振蕩器上150 r/min、30℃培養24 h后，加入10 mL底物質量濃度為1 g/L的阿魏酸溶液繼續培養24 h。發酵結束后，對各菌株轉化阿魏酸產香蘭素的能力進行測定和比較，并計算出各自的香蘭素摩爾轉化率和轉化效率，結果見表2。

表212　株菌株香蘭素轉化能力的比較Table 2 Comparison of conversion ability of ferulic acid by twelve strains

由表2可知，從香蘭素的產量看，細菌轉化阿魏酸產生的香蘭素質量濃度均高于真菌（酵母菌、絲狀真菌），其中B7和陰溝腸桿菌E1所產生的香蘭素質量濃度最高，而絲狀真菌中除了黑曲霉A1以外，杯珊瑚菌C2、美味牛肝菌B2和雞油菌C3所產生的香蘭素質量濃度均較低；從摩爾轉化率分析，除B7、黑曲霉和陰溝腸桿菌外，其他菌株的摩爾轉化率均＜10%；從轉化效率看，細菌的轉化效率均高于真菌的轉化效率，其中B7、黑曲霉、嗜熱脂肪芽孢桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、惡臭假單胞菌的轉化效率高于其他菌株，而B7的轉化效率是所有12株菌株中最高的。因此，通過篩選和比較，最終確定B7為目標菌株，進行后續試驗并對其進行純化、鑒定及保藏。

2.4香蘭素定性試驗結果

用毛細管分別吸取香蘭素和阿魏酸的標準液以及發酵液于制備好的GF254薄板上，放置點好樣的薄層板于裝有展開劑的展缸內進行層析，層析后取出揮干，在紫外檢出器下觀察藍紫色斑點。取天然香蘭素標準樣品、阿魏酸標準樣品、發酵后的發酵液進行薄層試驗，得到菌株B7的薄層層析色譜圖見圖3。

圖3　薄層層析結果Fig.3 Results of thin layer chromatography

薄層層析法可用于定性測定并指示反應的進程，在展開劑為乙酸乙酯∶乙醇∶二氯甲烷∶水（2.0∶3.5∶3.5∶1.0，V/V）的層析體系中，發酵液中的阿魏酸和香蘭素都能夠得到很好地分離。由圖3可知，經過測量和計算，Rf香蘭素=0.86；Rf阿魏酸= 0.62。觀察到在發酵液的條帶上，有兩個熒光點，一個為深紫色，與旁邊香蘭素標準溶液條帶上出現的熒光點顏色和位置都一致（即具有相同的Rf值），則說明該發酵液中有香蘭素生成。

2.5菌株鑒定

2.5.1B7菌株形態

菌株B7革蘭氏染色呈陽性，其顯微鏡下的鏡檢菌株形態見圖4，菌落形態見圖5。由圖4可知，菌體形態為長桿狀，以成對或鏈狀排列，菌體的大小為（0.8～1.2）×（2.0～3.8）μm，形成芽孢，芽孢中生或近中生，孢子囊不膨大。

圖4　菌株B7的鏡檢形態Fig.4 The micrograph of strain B7

由圖5可知，在平板培養基上生長的菌株B7的菌落呈白色或微黃色，單個菌落近似圓形，邊緣較整齊，半透明，菌落表面光滑濕潤。

圖5　B7的平板培養菌落形態Fig.5 Colonial morphology of strain B7

2.5.2生理生化試驗結果

表3　菌株B7的生理生化特征Table 3 The physiological and biochemical characteristics of strain B7

由表3可知，菌株B7芽孢染色和革蘭氏染色均呈陽性；5%的過氧化氫溶液的載玻片上，觀察有大量的氣泡產生，反應呈陽性；將B7分別于葡萄糖、蔗糖、乳糖發酵培養基上穿刺培養，觀察結果顯示乳糖培養基仍為藍色，而葡萄糖和蔗糖培養基變為黃色，說明該菌株可以利用葡萄糖和蔗糖，但不能利用乳糖；將B7接種于水解淀粉試驗培養基上培養24 h后，向固體平板培養基表面滴加盧哥氏碘液，使碘液鋪滿平板，平板呈藍色，說明該菌可以水解淀粉；在V-P試驗中，B7接種培養后，培養基變為藍色，說明該菌可以利用檸檬酸鹽；菌株其他生理生化試驗結果見表3。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，參考對照《常見細菌系統鑒定手冊》分類系統中的描述，初步鑒定B7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.5.3菌株16S rRNA基因序列鑒定及構建系統發育樹

PCR產物經瓊脂糖電泳檢測，結果見圖6。由圖6可知，其PCR產物為一個大小約為1 400 bp的特異性片段，菌株B7的16S rRNA全長序列大小為1 437 bp。之后在NCBI在線數據庫中進行序列比對的過程中發現，其與Bacillus屬中編號為DQ923483.1的菌株Bacillus subtilis的同源性達到99.7%，然后借助構建系統發育MEGA 4.0軟件生成直觀清晰的系統發育樹，結果見圖7。

圖6　菌株B7的PCR產物電泳圖譜Fig.6 The electrophoresis pattern of PCR products of strain B7

圖7　菌株B7的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain B7

由圖7可知，菌株B7與Bacillus subtilis（DQ923483.1）處在同一個分支上，通過1 000次bootstrap測試分析支持該分支；并且在GenBank數據庫比對過程中發現，菌株B7與模式菌株Bacillus subtilis（DQ923483.1）的16S rRNA基因序列相似度為99.7%，由此推斷菌株B7為Bacillus屬中的Bacillus subtilis。

綜上所述，結合菌株形態學特征、生理生化試驗結果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統發育分析結果，最終將菌株B7鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3　結論

本研究從化妝品廠排污口處深層土壤中篩選能夠轉化阿魏酸產香蘭素的菌株，從中篩選到14株菌株，其中5株具有轉化阿魏酸產香蘭素的能力，并通過與研究中心實驗室購買和保存的其他11株菌株進行比較，最終篩選出了一株香蘭素摩爾轉化率和轉化效率相對較高的菌株B7，結合菌株形態學特征、生理生化試驗結果和菌株16S rRNA序列分析鑒定及系統發育分析結果，最終鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

高產菌株以阿魏酸為底物生物法合成香蘭素的生產工藝潛力巨大，利用麥麩、谷糠等價格低廉的農副產品得到的阿魏酸轉化香蘭素，不但轉化速率快，而且可以降低生產成本，提高農副產品的利用率。隨著生物技術的進一步發展，一旦微生物發酵生產香蘭素實現工業化，必將推動香蘭素產業跨上一個新臺階。

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Screening and identification of a strain transforming ferulic acid to vanillin

YAN Xiaojuan，SONG Yongqiang*，NIU Ben，HU Xianwang
（Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，China）

The bacteria were isolated from soil by gradient dilution plate separation method.In final，a strain B7 with relatively high conversion capability of vanillin was screened by comparing with other 11 strains purchased and preserved in laboratory of research center.Through strain morphological characteristics，physiological and biochemical test results，16S rRNA sequence identification and phylogenetic analysis results，the strain B7 was inditified asBacillus subtilis.

ferulic acid；vanillin；screening；identification

TS252.54

A

0254-5071（2015）10-0047-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.011

2015-09-12

甘肅省食品酶制劑共性關鍵技術研究創新團隊（098TTCA013）；甘肅省技術研究與開發專項計劃（1205TCYA034）；甘肅省重點實驗室建設計劃項目（1309RTSA025）

嚴曉娟（1983-），女，工程師，碩士，研究方向為應用微生物。

宋勇強（1988-），男，工程師，碩士，研究方向為食品微生物學與發酵工程。