白色類諾卡氏菌的分離鑒定及其抗菌活性初探

雒曉芳，陳俊楠，田丹妮，汪如婷，馬麟龍，莫芳芳

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

白色類諾卡氏菌的分離鑒定及其抗菌活性初探

雒曉芳1，陳俊楠2，田丹妮2，汪如婷2，馬麟龍2，莫芳芳2

（1.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

該研究對白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus）進行分離鑒定，并通過溫度、紫外、酸堿處理，以綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、暗黑微綠鏈霉菌（Streptomyces atrovirens）為指示菌，用瓊脂打孔法進行抑菌實驗；用藥敏片法進行藥敏實驗，初步探討分離菌株的藥物敏感性以及抑菌性。結果表明，紫外作用30 min及溫度對其抑菌性影響不大；強酸、強堿環境中白色類諾卡氏菌基本沒有抑菌活性。白色類諾卡氏菌對抗生素較為敏感，藥敏性較高。

白色類諾卡氏菌；分離鑒定；抑菌活性；藥敏性

放線菌（Actinomycete）是微生物的一類菌群，存在極大的經濟、使用價值，其產生的抗生素和次生代謝產物在農業方面、醫療方面有重大作用［1］。放線菌是產生抗生素活性物質最多的一類微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是由放線菌產生的。利用鏈霉菌（Streptomyces）［2］產生的抗病菌活性物質對植物病害進行生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產、無毒無害等優點［3］。從天然資源中尋找活性物質代替化學農藥和使用天然抗菌化合物保護作物已成為當前研究的重點［4-5］。

放線菌中的白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus）生活在自然界的各種環境中，以孢子或菌絲的狀態存在。不論數量和種類，以土壤中最多。成萬上百萬的孢子聚集生活在一克土壤中；但是由于土質、氣候等條件的影響，一般情況下，肥沃的土壤中白色類諾卡氏菌多，偏酸性土中的菌株比中堿性土中的菌株含量少。白色類諾卡氏菌的菌落組成是菌絲體，一般圓形、光平或有許多皺褶。白色類諾卡氏菌產生的抗生素中90%是鏈霉菌產生。常見的鏈霉素（streptomycin）、土霉素（oxytetracycline）、絲裂霉素（mitomycin）；醫學上抗腫瘤的博萊霉素（bleomycin）、抗結核的卡那霉素（kanamycin）；抗真菌的制霉菌素以及井岡霉素（validamycin）等，都是鏈霉菌的次生代謝產物。此外諾卡氏菌是目前已分離鑒定的烷烴降解菌之一［4］，諾卡氏菌屬（Nocardia）能利用石油中的烷烴為碳源，從而降解石油。雖然有從石油污染土壤中分離出高效降解的菌株的研究［5］，但是，有關白色類諾卡氏菌的研究卻很少見［6-10］，因此，本研究對篩選出的這株白色類諾卡氏菌進行了初步鑒定，并探索其抑菌活性及藥敏性，為進一步治理石油污染奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株來源

白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus，Na）是由本校實驗室以甘肅隴東地區西峰市油田附近的含油土壤為菌源，用原油作為唯一碳源進行平板劃線篩選分離得到。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida，Pp）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）、暗黑微綠鏈霉菌（Streptomyces atrovirens，Sa）這4株指示菌均由西北民族大學實驗中心微生物實驗室提供。

1.1.2抗生素藥敏片

四環素、頭孢曲松、丁胺卡那霉素、先鋒霉素Ⅵ、卡那霉素、麥迪霉素、氯霉素、先鋒霉素Ⅳ、新霉素、萬古霉素、強力霉素、先鋒霉素Ⅴ等藥敏片均由均由西北民族大學實驗中心微生物實驗室提供。

1.1.3培養基

無機鹽培養基：NaNO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO41g/L，無水MgSO40.05g/L，無水CaCl20.01g/L，NaCl0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.2，石油5 g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

原油油培養基：無機鹽培養基500 mL，原油3 g，若需要配制固體培養基應另加入瓊脂10 g，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營養肉湯培養基：營養肉湯18 g/L，瓊脂15 g/L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

斜面保存培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2儀器與設備

SSW-CJ-ZF超凈工作臺、HH.B11.600-BS-Ⅱ電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；ZWY-200D多振幅軌道式恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌器：日本Hirayama公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ES-300E電子天平：長沙湘平科技發展有限公司。

1.3方法

1.3.1白色類諾卡氏菌的分離篩選

取5 g含油土壤加入有400 mL無機鹽培養基的1 L的三角燒瓶中，于30℃、180 r/min的恒溫振蕩條件下培養，7 d后取10 mL培養液轉接至新的原油培養基，相同環境培養7 d，重復此富集培養操作3次。

在無菌的環境下用接種環蘸取富集培養液，在原油平板上常規劃線后，平板于28℃恒溫培養箱中倒置培養48～72 h，然后將生長較好的形態不同的單個菌落在原油培養基上進行純化，做平板劃線分離，純化。將純化的菌株在固體無機鹽培養基上劃線，再向無機培養基中加入原油，使原油保持為0.5%的含量，于30℃溫箱中培養，選出在原油平板上生長較快的菌株，以牛肉膏蛋白胨純化并用牛肉膏蛋白胨斜面保存，置于4℃冰箱備用。

1.3.2白色類諾卡氏菌的鑒定

根據《常見形態觀察和生理生化特性指標的測定細菌系統鑒定手冊》［11］和《放線菌系統學原理、方法及實踐》［12］中所列各項實驗內容進行檢測。

1.3.3抑菌實驗準備

將冰箱保存的白色類諾卡氏菌株接種到含有30 mL營養肉湯液體培養基的50 mL錐形瓶中，30℃、130 r/min恒溫振蕩培養48 h。Sa菌株接種到含有30 mL營養肉湯液體培養基的50 mL錐形瓶中，30℃、130 r/min恒溫振蕩培養48 h。Pa、Pp、Bs分別接種到含有30 mL營養肉湯液體培養基的50mL錐形瓶中，37℃恒溫培養48h。將活化好的Pa、Pp、Bs、Sa稀釋至10-2，待用。分別配制1mol/LHCl和1mol/L NaOH溶液100 mL，待用。

1.3.4抑菌試驗

（1）白色類諾卡氏菌株對紫外線的穩定性

將活化的白色類諾卡氏菌置于紫外光下照射30 min。待用。

實驗組（A）：無菌環境下取12個無菌培養皿，分為4組，每組3個重復。倒入營養肉湯固體培養基制成平板。待培養基冷卻后，每組的平皿分別加入100 μL稀釋好的Pa、Pp、Bs、Sa菌液，用涂布棒涂布均勻，放置10 min。用滅好菌的打孔器在培養基上打孔7個，孔要分布均勻。每組分別加入適量白色類諾卡氏菌（紫外處理）。靜置1 h后放入恒溫培養箱中28℃培養12～24 h；測量抑菌圈的直徑，觀察抑菌圈邊緣整齊度。

對照組（CK）：無菌環境下取4個無菌培養皿。倒入營養肉湯固體培養基制成平板。待培養基冷卻后，每組的平皿分別加入100 μL稀釋好的Pa、Pp、Bs、Sa菌液，用涂布棒涂布均勻，放置10 min。用滅好菌的打孔器在培養基上打孔7個，孔要分布均勻。每組分別加入適量白色類諾卡氏菌。靜置1 h后放入恒溫培養箱中28℃培養12～24 h，測量抑菌圈直徑。

（2）白色類諾卡氏菌對溫度的穩定性

取2份活化的白色類諾卡氏菌分別放于28℃和55℃水浴鍋中處理30 min，再按1.3.4步驟操作并測量抑菌圈直徑。

（3）白色類諾卡氏菌對酸堿的穩定性

取2份活化的白色類諾卡氏菌分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調節pH值為4、10，室溫條件下靜置1 h，再將各處理恢復至pH 7，等體積比稀釋白色類諾卡氏菌，再按1.3.4步驟操作并測量抑菌圈直徑。

1.3.5藥敏試驗

取6個無菌培養皿倒入營養肉湯固體培養基制成平板，分為2組，每組3個重復。培養基冷卻后，每個平板加入300 μL白色類諾卡氏菌，涂布均勻，放置10 min。用滅好菌的鑷子將藥敏片緊貼在培養基上，靜置15 min，再放入37℃電熱恒溫培養箱培養12～24 h，測量抑菌圈直徑。（注意：藥敏片間距離＞28 mm，距離平板邊緣＞16 mm。）

2　結果與分析

2.1白色類諾卡氏菌的初步篩選

本實驗所用的白色類諾卡氏菌是從油田受污染土樣中，以石油為唯一碳源分離篩選得到的。菌株培養2 d后顯微鏡觀察，結果見圖1。

圖1　菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of the strain

由圖1可知，此株菌生長旺盛，菌落為圓形，乳白色，不透明，邊緣整齊，表面光滑有光澤，細胞均為絲狀，無運動性。孢子形態和菌落形態均符合杜慧竟等［13］對類諾卡氏菌屬特點的描述。

2.2菌株生理生化測試

白色類諾卡氏菌株的生理生化特征實驗結果見表1。由表1可知，白色類諾卡氏菌可使石蕊牛奶不凝固但會發生胨化、明膠發生液化、淀粉發生水解；能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、果糖、甘露醇以及利用蔗糖；不能利用肌醇，纖維素不水解，不還原硝酸鹽。根據參考文獻［3］和［13］，初步判斷該菌株為白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus）。

表1　白色類諾卡氏菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Nocardioides albus

2.3菌株抑菌性

2.3.1紫外線對白色類諾卡氏菌抑菌性的影響

圖2　紫外處理對抑菌圈直徑的影響Fig.2 Effect of ultraviolet treatment on antimicrobial diameter

由圖2可知，白色類諾卡氏菌株經紫外處理以后對菌Pa、Pp、Bs、Sa的抑制性有減小的趨勢，其中對于枯草芽孢桿菌Bs菌的抑制性減小趨勢最大，對暗黑微綠鏈霉菌Sa菌的抑制性減小趨勢最小，說明Bs菌對白色類諾卡氏菌菌株的變化最敏感。紫外作用30 min對白色類諾卡氏菌產生的抑菌物質影響甚小，此研究結果與肖懷東等［14］報道的在紫外下作用30min，抑菌活性基本沒有改變的結果一致。

2.3.2溫度對白色類諾卡氏菌抑菌性的影響

圖3　不同溫度處理對抑菌圈直徑的影響Fig.3 Effect of different temperature treatment on antimicrobial diameter

由圖3可知，每株指示菌在28℃低溫和55℃高溫處理下抑菌圈直徑有減小的變化，但是枯草芽孢桿菌Bs菌的抑菌圈直徑變化趨勢最小，說明白色類諾卡氏菌對Bs菌的抑制性較其他幾株指示菌更加穩定。結果表明，白色類諾卡氏菌株對實驗所選用的這幾株指示菌在高溫下抑制性比低溫下的抑制性更小，可能是由于白色類諾卡氏菌在相對低溫下抑菌性更加穩定［15］。

2.3.3pH值對白色類諾卡氏菌抑菌性的影響

由圖4可知，酸堿處理白色類諾卡氏菌菌后，抑菌圈直徑呈現大幅度的減小趨勢，其中酸處理組菌Pa、Pp抑菌圈直徑相對堿處理組抑菌圈直徑偏小，而菌Bs、Sa出現抑菌圈直徑基本一樣。說明在強酸、強堿環境中白色類諾卡氏菌基本沒有抑菌活性；在堿性的環境下較酸性的環境下相對穩定一些，在酸性條件下，H+可以與營養物質結合，并能從可交換的結合物或細胞表面置換出陽離子，從而影響細胞結構的穩定性［15］。此實驗結果與肖遠東等的研究結果一致［14］。

2.4白色類諾卡氏菌的抗菌素敏感性

圖5　不同抗生素處理條件對抑菌圈直徑的影響Fig.5 Effect of different antibiotic treatments on antimicrobial diameter

白色類諾卡氏菌的藥敏試驗結果見圖5。由圖5可知，白色類諾卡氏菌株對強力霉素和四環素最敏感，抑菌圈直徑≥25 mm，對頭孢曲松、丁胺卡那霉素、先鋒霉素Ⅵ、卡那霉素、麥迪霉素、氯霉素、先鋒霉素Ⅳ、新霉素、萬古霉素的敏感程度則相差不大，抑菌圈直徑15～25 mm，而只有對先鋒霉素Ⅴ表現出耐藥性。結果表明，白色類諾卡氏菌對抗生素比較敏感，藥敏性較高。

3　結論

通過實驗從石油污染的土壤中分離出的白色類諾卡氏菌菌株進行形態觀察和生理生化特征檢測，將該菌株歸屬于白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus）。通過對白色類諾卡氏菌進行紫外照射、溫度處理、酸堿處理的結果顯示，紫外作用30 min對白色類諾卡氏菌菌產生的抑菌物質影響甚小；此外，溫度對白色類諾卡氏菌產生抑菌物質有微弱的影響，且在相對低溫下抑菌性更加穩定；經過強酸、強堿處理后，白色類諾卡氏菌所產生的抑菌物質基本沒有活性，且在堿性的環境下較酸性的環境下相對穩定一些。選用12種抗生素對白色類諾卡氏菌菌株進行藥敏試驗，說明白色類諾卡氏菌對抗生素比較敏感，藥敏性較高。

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Separation and identification ofNocardioides albusand preliminary research on its antibacterial activity

LUO Xiaofang1，CHEN Junnan2，TIAN Danni2，WANG Ruting2，MA Linlong2，MO Fangfang2
（1.Center of Experiment，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China；2.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationality，Lanzhou 730030，China）

Nocardioides albuswas isolated and identified.The separated strains were treated with ultraviolet light，temperature and pH.Pseudomonas aeruginosa，Pseudomonas putida，Bacillus subtilisandStreptomyces atrovirenswere used as indicating bacteria，and the antibacterial experiment was conducted with agar diffusion method.Then drug sensitivity test was completed by drug sensitivity test，in order to exploring drug sensitivity and bacteriostatic activity of separated bacteria preliminarily.The results showed that UV treatment for 30 min and temperature treatment had little effect on antibacterial properties.TheN.albusstrain almost had no antibacterial activity under acid and alkali environments.The results showed thatN.albus was sensitive to antibiotics，and its drug sensitivity was high.

Nocardioides albus；separation and identification；antibacterial activity；drug sensitivity

Q93

A

0254-5071（2015）10-0058-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.013

2015-06-16

2013年甘肅省自然科學基金項目（1308RJZA187）；2014年甘肅省教育廳項目（2014B-010）；2015年西北民族大學開放項目；西北民族大學2015年大學生創新創業訓練計劃項目（201510742079）

雒曉芳（1980-），女，副教授，碩士，主要從事環境微生物方面的研究工作。