大腸桿菌產海藻糖合成酶發酵條件優化

楊梅玉，趙　偉，陳文娜，張曰輝，曹大鵬

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

大腸桿菌產海藻糖合成酶發酵條件優化

楊梅玉，趙偉，陳文娜，張曰輝，曹大鵬

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

采用單因素試驗和正交試驗，研究海藻糖合成酶發酵過程中加誘導劑時菌濃OD600nm、誘導溫度、誘導時間、海藻糖合成酶轉化海藻糖時間4個因素對轉化率的影響，確定大腸桿菌產海藻糖合成酶轉化海藻糖的最優條件組合。結果表明，轉化時間和誘導溫度對轉化率的影響較大，在大腸桿菌生長到菌濃OD600nm值為0.8時加誘導劑，誘導溫度26℃保持8 h，在轉化過程中反應14 h為最佳搭配。在此最佳條件下，海藻糖的轉化率可達69.29%。

海藻糖；海藻糖合成酶；大腸桿菌；發酵條件

海藻糖（trehalose）又稱α-D-吡喃葡糖苷基-α-D-吡喃葡糖苷，是一種非還原性二糖，無毒無害，在自然界中許多可食用的動植物及微生物體內廣泛存在，被稱為“生命之糖”［1-2］。海藻糖具有良好的穩定性和獨特的生物學特性，如對生物體和生物大分子具有優良的抗逆保護作用。大量研究表明，生物體對外界環境脅迫（如干燥、高溫、高滲透壓、輻射等）表現出的抗逆耐受力與其體內存在的海藻糖有直接關系［3-6］。海藻糖的生產方法主要有天然生物提取法、微生物發酵法、化學合成法、基因工程法和酶轉化法［1］。其中酶轉化法生產海藻糖一直是工業生產海藻糖的主要途徑。海藻糖合成酶（trehalose synthase）是生產海藻糖的工業酶，其通過轉糖基作用直接將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵轉化為α-1，1糖苷鍵生成海藻糖，反應流程短，非常容易調節和控制，既不需要消耗高能物質，也不需要與磷酸鹽共存，海藻糖的轉化率高且不受麥芽糖濃度的影響，麥芽糖價格低廉易得，因此在工業化生產海藻糖中具有良好的應用前景［7-10］。

海藻糖合成酶主要存在于微生物細胞中［11］，大部分已發現的野生菌株存在細胞海藻糖合成酶酶活較低，海藻糖產率低等問題，目前工業應用的菌種一般均為基因工程菌。黃英等［12］在大腸桿菌（Escherichia coli）中采用克隆技術表達了玫瑰鏈霉菌（Streptosporangium roseum）海藻糖合成酶基因，所產的海藻糖合成酶可轉化82%以上的麥芽糖形成海藻糖。高超等［13］將哈氏噬纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）中克隆獲得的海藻糖雙功能合成酶基因（tpsp）表達到E.coli中，通過發酵罐轉化，海藻糖的產量達到13.3 g/L。宿玲恰等［14］通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增獲得來源于嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S，構建了基因工程菌E.coli，通過搖瓶工藝優化，轉化率最高49.0%。

本研究通過單因素試驗和正交試驗，檢測海藻糖合成酶發酵過程中加誘導劑時的菌濃OD600nm、誘導溫度、誘導時間、海藻糖合成酶轉化海藻糖過程中轉化時間4個因素，尋找大腸桿菌產海藻糖合酶轉化海藻糖的最優條件組合，為海藻糖工業化生產提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

大腸桿菌（Escherichia coli）：山東福洋生物科技有限公司。

1.1.2培養基

種子培養基：NaCl 10 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氨芐西林鈉0.1 g/L。

發酵培養基：葡萄糖4.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH2PO43.0 g/L、Na2HPO4·12H2O 15.1 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、無水CaCl20.01 g/L、玉米漿1 mL/L、氨芐西林鈉0.1 g/L，25%氨水和5%的磷酸，控制pH 7.0。

1.1.3試劑

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、氯化銨、無水氯化鈣（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；海藻糖：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；氨水：萊陽市康德化工股份有限公司；注射用氨芐西林鈉：山東魯抗醫藥股份有限公司。

1.2儀器與設備

15 L發酵罐和過程參數檢測與控制系統FUS-15L（A）：國家生化工程技術研究中心（上海）；尾氣過程質譜儀MAX300-LG：美國Extrel公司；InPro3250 pH電極和Inpro 6800溶氧電極：美國METTIER TOLEDO公司；LC-20AT型高效液相色譜儀（配Waters 515泵、Waters 2414型示差折光檢測器、N2000雙通道色譜工作站）：美國Waters公司；722型分光光度計：上海奧譜勒儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1海藻糖合成酶的誘導

將低溫保存的大腸桿菌菌株QB1接種到種子培養基中活化，在搖床上轉速220 r/min，溫度37℃條件下培養6～8 h。無菌條件下轉接到15 L發酵罐中，接種量1%，在溫度37℃、轉速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發酵大腸桿菌。當菌種達到適當菌濃時降低溫度，流加終含量為0.2%的乳糖誘導。

1.3.2海藻糖合成酶粗酶液的制取

誘導后的大腸桿菌發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發酵液體積，配成菌懸液，勻漿機破碎3次，即得到海藻糖合成酶粗酶液。

1.3.3海藻糖合成酶轉化海藻糖

以終含量為30%的麥芽糖水溶液作為底物進行轉化，具體為150 mL三角瓶中加入20 mL 75%的麥芽糖和30 mL粗酶液，混勻，于55℃、120 r/min搖床中反應。結束后取出，沸水浴10min滅酶，冷卻過濾后用超純水稀釋100倍，0.22μm微孔濾膜過濾后進行海藻糖含量的測定。

1.3.4海藻糖轉化率的測定

采用高效液相色譜法分析轉化液中海藻糖的含量［15］。色譜條件：流動相為乙腈/水=4∶1，混勻后加0.1%的氨水作為保護劑。色譜柱為XBridgeTMNH2（3.5 μm×4.6 μm× 250 mm），柱溫35℃，檢測器為示差折光顯示器，檢測器溫度40℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

海藻糖標準曲線的制作：用超純水分別配制海藻糖質量濃度分別為0、0.6 g/L、1.2 g/L、1.8 g/L、2.4 g/L和3 g/L的標準溶液，高效液相分析后以海藻糖質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程，y=247 967x+11 266，相關系數R2=0.999 2。根據回歸方程計算樣品中海藻糖的含量。

1.3.5發酵條件優化

（1）單因素試驗

檢測4個因素對海藻糖轉化率的影響：海藻糖合成酶發酵過程中加誘導劑時的菌濃OD600nm、誘導溫度、誘導時間、海藻糖合成酶轉化海藻糖過程中轉化時間。

（2）發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果進行正交試驗分析，以海藻糖轉化率為評價指標，確定正交試驗4因素的水平范圍。正交試驗因素與水平見表1。

表1　發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1菌體濃度對轉化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發酵罐中，在溫度37℃、轉速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發酵大腸桿菌。當不同罐中大腸桿菌菌濃OD600nm分別達到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時，溫度均降為26℃，添加終含量為0.2%的乳糖誘導8h。下罐發酵液在10000r/min條件下離心10min收集菌體，用50mmol/L磷酸緩沖溶液（pH7.0）洗滌菌體，并定容至原發酵液體積，配成菌懸液，勻漿機破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中反應12 h，沸水浴10 min滅酶后測定海藻糖的轉化率，結果見圖1。

圖1　菌體濃度對轉化率的影響Fig.1 Effect of bacteria concentration on conversion rate

由圖1可知，海藻糖的轉化率隨時間的延長而先增加再降低，在大腸桿菌生長至OD600nm為0.8時海藻糖的轉化率最大，為66.47%。因此，發酵罐中大腸桿菌菌濃OD600nm為0.8時加乳糖誘導最佳。在菌體對數生長中期添加乳糖誘導效果最佳，不但可以獲得較高的菌體濃度，還能得到較高的海藻糖合成酶，有利于提高海藻糖的轉化率。

2.1.2誘導溫度對轉化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發酵罐中，在溫度37℃、轉速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發酵大腸桿菌。當罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達0.8時，不同罐的溫度分別設置為22℃、24℃、26℃、28℃、30℃時，流加終含量為0.2%的乳糖誘導8 h。下罐發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發酵液體積，配成菌懸液，勻漿機破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中反應12 h，沸水浴10 min滅酶后測定海藻糖的轉化率，結果見圖2。

圖2　誘導溫度對轉化率的影響Fig.2 Effect of induction temperature on conversion rate

由圖2可知，海藻糖的轉化率隨溫度的升高呈先增加再降低趨勢，誘導溫度控制在26℃時海藻糖的轉化率最大，為68.25%。因此，發酵罐中誘導大腸桿菌產海藻糖合成酶的溫度控制在26℃最佳。

2.1.3誘導時間對轉化率的影響

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發酵罐中，在溫度37℃、轉速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發酵大腸桿菌。當罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達到0.8時，溫度均降為26℃，流加終含量為0.2%的乳糖，分別誘導4 h、6 h、8 h、10 h、12 h。下罐發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發酵液體積，配成菌懸液，勻漿機破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30mL粗酶液和20mL75%的麥芽糖加入150mL錐形瓶中55℃、120r/min搖床中反應12 h，沸水浴10 min滅酶后測定海藻糖的轉化率，結果見圖3。

圖3　誘導時間對轉化率的影響Fig.3 Effect of induction time on conversion rate

由圖3可知，隨著誘導時間的延長，海藻糖的轉化率先呈增加趨勢，在誘導8 h時海藻糖的轉化率達最大，為67.68%，隨后有所降低。因此，即誘導時間8 h最佳。

2.1.4轉化時間對轉化率的影響

圖4　轉化時間對轉化率的影響Fig.4 Effect of transforming time on conversion rate

將活化后的大腸桿菌按接種量1%接種到15 L發酵罐中，在溫度37℃、轉速600 r/min、通氣量7.5 L/min、pH 7.0的條件下發酵大腸桿菌。當罐中大腸桿菌菌濃OD600nm達到0.8時，溫度均降為26℃，流加終含量為0.2%的乳糖誘導8 h。下罐發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）洗滌菌體，并定容至原發酵液體積，配成菌懸液，勻漿機破碎3次，得到海藻糖合成酶粗酶液。取30 mL粗酶液和20 mL 75%的麥芽糖加入150 mL錐形瓶中55℃、120 r/min搖床中分別反應8 h、10 h、12 h、14 h、16 h，沸水浴10 min滅酶后測定海藻糖的轉化率，結果見圖4。

由圖4可知，海藻糖的轉化率隨轉化時間的延長先增加后趨于平穩，在轉化12 h以后轉化率增加不顯著，根據經濟效益考慮，轉化時間12 h最佳。

2.2發酵條件優化正交試驗

將上述4個條件的單因素試驗進行正交分析，以海藻糖轉化率為評價指標，確定正交試驗4因素的水平范圍。正交試驗結果與分析見表2［16］，方差分析見表3。

表2　發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2極差R的大小順序可知，對海藻糖轉化率影響的主次順序為D＞B＞A＞C，即轉化時間＞誘導溫度＞菌濃OD600nm＞誘導時間，各因素的最優組合為A2B2C2D3，即最優搭配組合為菌濃OD600nm0.8時加誘導劑，誘導溫度26℃、誘導時間8 h、轉化時間14 h。在此最佳條件下，海藻糖轉化率平均值為69.29%。

由表3可知，4個因素對結果均無顯著影響。

3　結論

本試驗通過乳糖誘導大腸桿菌產海藻糖合成酶將麥芽糖轉化為海藻糖，經過單因素試驗和正交試驗，得知轉化時間和誘導溫度對轉化率的影響較大，在大腸桿菌生長到菌濃OD600nm為0.8時加誘導劑，誘導溫度26℃保持8 h，在轉化過程中反應14h為最佳搭配。在最佳條件下，海藻糖的轉化率可達69.29%。

大腸桿菌產海藻糖合成酶轉化海藻糖工藝條件的優化可以提高海藻糖的轉化率，而海藻糖合成酶在工業化生產海藻糖中具有良好的應用前景，因此大腸桿菌產海藻糖合酶轉化海藻糖的條件優化，為海藻糖工業化大規模生產提供參考依據。

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Optimization of fermentation conditions of trehalose synthase byEscherichia coli

YANG Meiyu，ZHAO Wei，CHEN Wenna，ZHANG Yuehui，CAO Dapeng
（Shandong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

For confirming the optimal condition of the transformation efficiency of trehalose synthase fromEscherichia coli，the effect of bacterial concentration OD600nm，induction time and temperature，and transformation time on trehalose conversion rate was researched by single factor and orthogonal tests.The results showed that the transformation time and induction temperature had great influence on trehalose conversion rate.The optimal condition was as follows:inducer was added when OD600nmequals 0.8，induction temperature was maintained at 26℃for 8 h，and reaction time 14 h in the transformation process.The conversion rate of trehalose was as high as 69.29%under the optimal condition.

trehalose；trehalose synthase；Escherichia coli；fermentation conditions

TQ929

A

0254-5071（2015）10-0078-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.017

2015-09-04

山東福洋生物科技有限公司項目

楊梅玉（1987-），女，工程師，碩士，主要從事微生物發酵及酶技術工作。