微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的研究

廖婷婷，石　彬，肖　兵，許　定，胡詠梅*

（華中農業(yè)大學生命科學技術學院農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢430070）

微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的研究

廖婷婷，石彬，肖兵，許定，胡詠梅*

（華中農業(yè)大學生命科學技術學院農業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢430070）

通過單因素試驗和正交試驗對藍莓酒糟中花青素的提取工藝進行了研究。結果表明，各因素對花青素提取量的影響從大到小依次為乙醇體積分數(shù)＞微波提取時間＞檸檬酸含量＞微波功率＞液固比；最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)60%，檸檬酸含量0.6%，液固比60∶1（mL∶g），微波功率420 W，微波提取時間20 s。在此最佳提取條件下，從藍莓酒糟中可提取花青素（1.847±0.079）mg/g，1次提取率達84.22%。

藍莓酒糟；花青素；提取工藝；微波輔助

近年來，各種合成色素層出不窮，擾亂了國內外的食品色素市場。合成色素幾乎都有不同程度的毒性，長期使用會危害人體健康。因此，人們迫切需要尋求天然無害的色素。花青素的出現(xiàn)無疑給人們帶來了希望。花青素（anthocyanin）是構成花瓣和果實顏色的主要色素之一，是一種類黃酮化合物，不僅具有抗氧化、抑制腫瘤、抑制炎癥、抗輻射和保護心臟等功效，而且可以有效降低血糖，幫助對抗肥胖以及作為飼料添加劑等［1-3］，因而越來越受到科研領域的關注。

鑒于花青素的諸多優(yōu)點，從植物中提取花青素成為熱門［4-12］。花青素的來源很多（如藍莓、桑葚、紫甘薯和紫玉米等），藍莓是花青素含量最多的水果。近年來，國內的藍莓種植面積和產量以年均50%的速度遞增。但由于保質期很短，除了作為鮮果銷售和加工成果汁、果醬外，藍莓并沒有得到充分的開發(fā)和利用，造成大量鮮果積壓和腐爛。而用藍莓釀酒不僅能有效保留藍莓的營養(yǎng)價值和保健價值，還可充分利用資源，豐富酒類品種，具有很大的競爭力和市場潛力。花青素是一種水溶性色素，可隨細胞液的酸堿而改變顏色—細胞液呈酸性則偏紅，呈堿性則偏藍。用藍莓釀制成的酒多呈寶石紅色或琥珀色，不僅在色澤和口感上比藍莓果、藍莓汁更具有吸引力，而且藍莓酒中的花青素和多種營養(yǎng)素更豐富且更易為人體吸收，因而被越來越多的人所接受與推崇。不過，釀造藍莓酒后的藍莓酒糟（仍含有2 mg/g左右的花青素，約為鮮果花青素含量的一半）往往被丟棄，不但資源沒有得到充分利用，還給環(huán)境造成了較大的污染，因此如何充分利用藍莓酒糟，從中提取出天然無公害的食用色素，是科研工作者亟待解決的難題之一。

目前，提取花青素的方法很多，相對于其他方法來說，微波輔助提取不僅可保持花青素的活性，而且具有設備簡單和提取效率快的優(yōu)點［13-15］。酸化乙醇或甲醇是花青素提取中常用的提取溶劑［16-22］，若采用檸檬酸代替鹽酸酸化乙醇，可保障提取的花青素更安全。本研究以藍莓酒糟為原料，研究微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的工藝參數(shù)，為天然色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，將藍莓酒糟變廢為寶，以期實現(xiàn)資源的最大利用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

藍莓酒糟：來源于華中農業(yè)大學生命科學技術學院發(fā)酵工程室，水分含量為75.10%，經冷凍干燥后含水量為2.50%，花青素含量為2.193 mg/g，于-20℃保藏。

冰醋酸、KCl、醋酸鈉、濃HCl、無水乙醇、檸檬酸等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

Alpha 1-2 LD plus凍干機：武漢遞愛生物科技公司；中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器公司；ST16R臺式高速冷凍離心機：北京嘉信恒潤科貿公司；722s可見分光光度計：上海精密科學儀器公司；PL303電子天平、FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器公司；M1-211A美的微波爐：廣東美的微波電器制造公司。

1.3試驗方法

1.3.1藍莓酒糟的預處理

將藍莓酒糟于-20℃冰箱冷凍24 h后，置于冷凍干燥器中，在升華溫度為-40℃的條件下冷凍干燥48 h，粉碎后過60目篩，于-20℃冰箱保藏備用。

1.3.2微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的單因素試驗

準確稱取冷凍干燥后的藍莓酒糟1.000 g置于錐形瓶中，分別設定不同的乙醇體積分數(shù)（20%、40%、60%、80%、100%）、提取時間（10 s、20 s、30 s、50 s、70 s、90 s）、檸檬酸含量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、液固比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g））及微波功率（140 W、280 W、420 W、560 W、700 W）進行提取，室溫浸提20 min。考察各影響因素對從藍莓酒糟中提取花青素的影響。

1.3.3微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取L16（54）正交設計進行5因素4水平的正交試驗，以花青素含量為評價指標，確定最佳的提取條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extraction conditions optimization

1.3.4花青素含量的測定

（1）緩沖溶液的配制：

根據(jù)參考文獻［22］配制氯化鉀-鹽酸緩沖液（pH 1.0）和醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）。

（2）pH示差法測定花青素含量

將藍莓酒糟花青素的提取液于25℃水浴鍋預冷20 min后，4 000 r/min離心10 min，然后用0.45 μm微孔濾膜過濾取濾液。取1.0 mL適當稀釋的濾液，分別加入9.0 mL的pH 1.0和pH 4.5的緩沖體系中，分別于波長510 nm和700 nm處測定吸光度值，花青素的提取量計算公式如下：

式中：TAcy為花青素提取量，mg/g；A=（A510nm-A700nm）pH1.0-（A510nm-A700nm）pH4.5；V為濾液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質量，449.2；m為原料質量，g；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)的消光系數(shù)，26 900；L為光程，1 cm。

2　結果與分析

2.1微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

圖1　乙醇體積分數(shù)對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the anthocyanin extraction yield of blueberry wine lees

由圖1可知，藍莓酒糟中花青素的提取量隨乙醇體積分數(shù)的增加先增大后減小。當乙醇體積分數(shù)為60%時，花青素提取量達到最大值，為（1.215±0.040）mg/g。因此，乙醇體積分數(shù)60%為宜。

2.1.2提取時間對花青素提取量的影響

圖2　微波提取時間對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the anthocyanin extraction yield of blueberry wine lees

由圖2可知，在供試的條件下，微波提取20 s時花青素提取量為（1.247±0.007）mg/g，達到最大值。繼續(xù)延長微波提取時間，花青素提取量不僅沒有明顯的增加，反而略有下降，分析原因可能是由于微波時間延長后，提取體系中的溫度過高導致花青素發(fā)生降解，從而影響了花青素的提取量，所以確定20 s作為最佳微波提取時間。

2.1.3溶劑中檸檬酸含量對花青素提取量的影響

圖3　檸檬酸含量對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.3 Effects of citric acid concentration on the anthocyanin extraction yield of blueberry wine lees

由圖3可知，檸檬酸在提取溶劑乙醇中的含量為0.4%時，花青素提取量達到峰值，為（1.485±0.028）mg/g。因此，檸檬酸含量0.4%為宜。

2.1.4液固比對花青素提取量的影響

圖4　液固比對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-to-solid ratio on the anthocyanin extraction yield of blueberry wine lees

由圖4可知，在檸檬酸含量為0.4%的條件下，在一定的范圍內，隨著液固比的增大，花青素提取量不斷提高，當液固比為50∶1（mL∶g）時，花青素的提取量達到最大，為（1.507±0.029）mg/g。繼續(xù)增大液固比時，花青素的提取量反而有所降低。因此，適宜的液固比為50∶1（mL∶g）。

2.1.5微波功率對花青素提取量的影響

由圖5可知，在檸檬酸含量為0.4%，液固比為50∶1（mL∶g）的條件下，在一定的范圍內，隨著微波功率的增長，花青素提取量不斷提高，當微波功率為420 W時花青素提取量達到峰值，為（1.690±0.053）mg/g。繼續(xù)增大微波功率，花青素提取量下降。因此，微波功率為420 W時為宜。

圖5　微波功率對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.5 Effects of extraction power on the anthocyanin extraction yield of blueberry wine lees

采用SPSS軟件對單因素試驗進行方差分析，結果表明，各因素對花青素提取的影響程度排序為：乙醇體積分數(shù)（P＜0.01）＞提取時間（P＜0.01）＞微波功率（P＜0.01）＞檸檬酸含量（P＜0.01）＞液固比（0.01＜P＜0.05）。

2.2微波輔助提取藍莓酒糟中花青素的正交試驗

2.2.1正交試驗結果與方差分析

根據(jù)單因素試驗及其方差分析的結果，選取L16（45）正交表進行正交試驗，以花青素提取量為考察指標，確定最佳的提取條件。正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　提取條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction conditions optimization

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

正交試驗結果（表2）和方差分析（表3）結果表明，各因素對花青素提取量的影響程度由大到小依次為乙醇體積分數(shù)＞微波提取時間＞檸檬酸含量＞微波功率＞液固比。在5個因素中，乙醇體積分數(shù)，提取時間和檸檬酸含量對花青素的影響為顯著水平（P＜0.05），而微波功率和液固比的影響不顯著，說明在花青素提取中，溶劑和提取時間極為重要。通過極差分析得到的正交最優(yōu)組合為A2B3C2D4E4，即乙醇體積分數(shù)為60%，微波提取時間20 s，微波功率為420 W，檸檬酸含量0.6%，液固比60∶1（mL∶g）。在此最佳條件下進行驗證試驗，花青素提取量為（1.847±0.079）mg/g。

2.2.2微波輔助提取藍莓酒糟花青素的得率

為探究藍莓酒糟中的花青素絕對含量以及該工藝的首次提取率，在最優(yōu)提取條件下對藍莓酒糟共進行了4次提取。如圖6所示，第4次提取時花青素的提取量接近零。合計4次提取量可知供試藍莓酒糟中花青素的總含量為2.193 mg/g；在最優(yōu)提取條件下，花青素的1次提取率可達84.22%。

圖6　提取次數(shù)對藍莓酒糟花青素提取量的影響Fig.6 Effects of extraction times on the anthocyanin yield of blueberry lees

3　結論

本試驗采用微波輔助對藍莓酒糟中的花青素提取工藝進行了研究。在單因素試驗的基礎上，采用L16（45）正交表進行了5因素4水平的正交試驗，對花青素的提取工藝進行了優(yōu)化。研究結果表明，各因素對花青素提取量的影響從大到小依次為：乙醇體積分數(shù)＞微波提取時間＞檸檬酸含量＞微波功率＞液固比。最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)60%，微波提取時間20 s，微波功率為420 W，乙醇中檸檬酸含量0.6%，液固比60∶1（mL∶g）。在此最佳提取條件下得到花青素提取量為（1.847±0.079）mg/g，1次提取率達到84.22%。

本研究采用微波輔助提取藍莓酒糟中的花青素，有以下幾個方面的優(yōu)勢：其一，在方法上，采用微波輔助提取，與傳統(tǒng)溶劑提取相比，花青素提取率提高了15個百分點，并且操作簡單，耗時短，與ZOU T等［23］中的結果相符；其二，在溶劑方面，采用乙醇為提取劑，相對常用的甲醇和丙酮而言，更安全，提取的花青素可用于食品、醫(yī)用以及化妝品等方面，增加了花青素使用的廣泛性，而且，用檸檬酸替代普遍使用的乙醇酸化劑鹽酸，能有效避免Cl-污染；其三，從原料上看，目前國內外直接從水果中提取花青素的研究報道較多，而從藍莓酒糟中提取花青素較少。藍莓酒糟中還有較多未能完全浸入到酒中的花青素，直接丟棄既浪費資源又污染環(huán)境。

本研究采用單因素試驗和正交試驗對藍莓酒糟中花青素的提取工藝作了初步的研究，為工業(yè)化生產的藍莓酒糟的利用奠定了良好的基礎。在此基礎上，可采用響應面試驗設計作進一步的研究，并找到合適的純化方法對花青素提取液進行純化，以得到高純度的花青素產品。

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Optimization of microwave-assisted extraction process for anthocyanin from blueberry wine lees

LIAO Tingting，SHI Bin，XIAO Bing，XU Ding，HU Yongmei*
（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The extraction conditions of anthocyanin from blueberry wine lees were studied by single factor and orthogonal experiment.The results showed that the effect of each factor on the extraction of anthocyanin in order was ethanol concentration，extraction time，citric acid content，microwave power，and liquid-to-solid ratio.The optimum conditions were confirmed as follows:ethanol concentration 60%，citric acid concentration 0.6%，liquid-solid ratio 60∶1（ml:g），microwave power 420 W，extraction time 20 s.Under the optimal extraction conditions，the yield of anthocyanin was（1.847±0.079）mg/g and the extraction rate reached 84.22%.

blueberry wine lees；anthocyanin；extraction process；microwave-assisted

TS252.54

A

0254-5071（2015）10-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.025

2015-09-12

國家基金委國家基礎科學人才培養(yǎng)基金項目（No.201315）

廖婷婷（1990-），女，碩士研究生，研究方向為生理活性物質的開發(fā)與應用。

胡詠梅（1973-），女，副教授，博士，研究方向為應用微生物。