響應面分析法優化火棘果中原花青素提取工藝

吳　偉，曾倩蘭，向　福*

（1.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃州438000；2.湖北理工學院醫學院，湖北黃石435003；3.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃州438000）

響應面分析法優化火棘果中原花青素提取工藝

吳偉1，2，曾倩蘭2，向福1，3*

（1.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北黃州438000；2.湖北理工學院醫學院，湖北黃石435003；3.黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃州438000）

為了優化火棘果中原花青素的提取工藝，基于單因素試驗的結果，采用響應面分析法探討提取溫度、乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取次數對原花青素提取率的影響，確定火棘果中原花青素最佳提取工藝。結果表明，最佳提取條件為提取溫度70℃、乙醇體積分數70%、提取料液比1∶20（g∶mL）、提取時間4.0 h、提取3次，在此提取工藝條件下，所得原花青素的提取率為5.74%，與理論提取率接近。

響應面分析法；火棘果；原花青素；提取

火棘（Pyracantha fortuneana）又稱火把果、救軍糧，為薔薇科火棘屬植物，屬于常綠灌木［1］?；鸺Y源豐富，具有較高的觀賞價值，其果實具有很高的食用價值和藥用價值［2-3］。火棘果為原料的保健果酒、飲料等已經在市面上有售。火棘的藥用在《滇南本草》、《本草綱目》等都有記載［4］。根主治虛勞骨蒸、濕熱痹痛、月經不調、跌打損傷等癥狀；果實主治脾胃虛弱、消化不良、泄瀉、痢疾、疳積、崩漏、白帶、產后腹痛等病癥；葉主治血崩及貧血、閉經和爆發性火眼、外敷治療瘡殤腫毒［5］。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是含雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑之一［6-7］。一般為紅棕色粉末，氣微、苦澀，溶于水和大多數有機溶劑。原花青素分布廣泛，主要存在于植物的根、莖、葉、皮、殼等，低聚原花青素廣泛存在于各種水果的皮、核、梗中［8］。原花青素是一種新型高效抗氧化劑，是目前為止所發現的最有效的自由基清除劑，具有非常強的體內活性［9］。

響應面分析法是目前最常用的工程類優化方法，它是基于統計學的綜合實驗技術，來解決復雜系統變量與相應之間關系的一種方法，通過對所需分析的相應受多個變量影響的問題進行建模和分析，從而優化該響應［10］。所以，響應面優化法廣泛應用于生物工程、食品工程以及其他工程領域的過程優化［11-12］。目前對火棘果的研究主要集中在營養成分、功效方面，對其有效成分如原花青素的的有效提取鮮有報道。本研究在單因素的基礎上，利用響應面優化試驗對火棘果中原花青素提取工藝條件進行優化，確定最佳的提取工藝條件，為充分利用火棘果資源提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

火棘果：采自湖北理工學院植物園，粉碎后保存備用。

無水乙醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限責任公司；兒茶素標準品（色譜純）：上海金穗生物科技有限公司；香草醛（分析純）：湖南湘中地質實驗研究所；石油醚（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；甲醇（分析純）：武漢市洪山中南化工試劑有限責任公司；鹽酸（分析純）：中平能化集團開封東大化工有限公司試劑廠。

1.2儀器與設備

YP6002電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；SCQ-450超聲波清洗器：上海盛普機械制造有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海姚氏儀器設備廠；RE-3000旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；SF-130C萬能粉碎機：吉首市中誠制藥機械廠；752SP紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HWS26水浴鍋：上海一恒科學有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1兒茶素標準曲線的制備［13］

分別吸取質量濃度1.0 mg/mL的兒茶素標準液各0.125 mL、0.250mL、0.375mL、0.500mL、0.625mL、0.750mL、0.875 mL、1.000 mL至25 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋成質量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL，搖勻，再分別加入15 mL 4 g/100 mL香草醛-甲醇溶液和7.5 mL濃鹽酸，定容，混勻。在30℃水浴避光反應30 min后，用甲醇代替標準品作空白對照，于波長500 nm處測定吸光度值，以兒茶素質量濃度（x）為橫坐標，對吸光度值（y）為縱坐標，繪制兒茶素標準曲線。

1.3.2樣品溶液的制備與含量測定

將火棘果磨粉過篩后，稱取1 g火棘果粉末，置于圓底燒瓶中，加入適量的乙醇，在一定溫度和時間下提取，將濾渣再次在相同的條件下提取。合并濾液，減壓濃縮，得到樣品溶液。

根據兒茶素標準曲線回歸方程計算出原花青素含量，并計算原花青素的提取率。原花青素的提取率計算公式如下：

1.3.3單因素試驗

分別考察乙醇體積分數（65%、70%、75%、80%、85%、90%）、提取溫度（60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、提取時間（2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h）和提取次數（1、2、3、4、5）對火棘果中原花青素提取率的影響。

1.3.4響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對火棘果中原花青素提取工藝進行優化，選取提取溫度（X1）、乙醇體積分數（X2）、料液比（X3）3個因素為自變量，以原花青素提取率（Y）為響應面值，并以1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，響應面試驗設計因素與水平如表1所示。

表1　響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

2　結果與分析

2.1兒茶素標準曲線的繪制

以兒茶素質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制兒茶素標準曲線，結果如圖1所示。

圖1　兒茶素標準曲線Fig.1 Standard curve of catechin

由圖1可知，兒茶素標準曲線回歸方程為y=7.45x+ 0.010 5，決定系數R2=0.993 4，表明兒茶素質量濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2單因素試驗結果

2.2.1乙醇體積分數對火棘果中原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對火棘果中原花青素提取率的影響結果見圖2。

圖2　乙醇體積分數對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the procyanidins extraction rate

由圖2可得，當乙醇體積分數為65%～70%時，隨著乙醇體積分數的變大，原花青素的提取率增大；在乙醇體積分數為70%時，原花青素的提取率最大，為6.762 1%；當乙醇體積分數＞70%后，隨著乙醇體積分數的增大，提取率變小。這可能是由于“相似相溶”原理，當溶劑的極性與原花青素的極性相近時，原花青素的提取率達到最大。因此，選取最佳提取乙醇體積分數為70%。

2.2.2提取溫度對原花青素提取率的影響

提取溫度對原花青素提取率的影響結果見圖3。

圖3　提取溫度對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the procyanidins extraction rate

由圖3可得，當提取溫度從60℃升至70℃時，隨著提取溫度的升高，原花青素的提取率變大；當溫度達到70℃時，提取率達到最大，為6.721 4%；當提取溫度＞70℃后，提取率隨著提取溫度的升高而減小，但提取率比提取溫度在60℃時高，可能是因為隨著提取溫度的升高，原花青素中熱不穩定的成分分解［14］。故選最佳提取溫度在70℃。

2.2.3料液比對原花青素提取率的影響

料液比對原花青素提取率的影響結果見圖4。

圖4　料液比對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on the procyanidins extraction rate

由圖4可得，當料液比為1∶15～1∶20（g∶mL）時，隨著料液比的增大，原花青素的提取率變大，溶劑增加后，隨著細胞破裂加劇，原花青素迅速進入溶劑；當料液比達到1∶20（g∶mL）時，提取率達到最大，為6.744 2%，原花青素濃度達到飽和；當料液比超過1∶20（g∶mL）后，隨著料液比的增大，提取率變小，原花青素達到飽和后反而抑制其從細胞的滲出。故取最佳選料液比在1∶20（g∶mL）。

2.2.4提取時間對原花青素提取率的影響

提取時間對原花青素提取率的影響結果見圖5。

圖5　提取時間對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the procyanidins extraction rate

由圖5可得，當提取時間為2.0～4.0 h時，隨著提取時間的延長，原花青素的提取率增大；當提取時間達到4.0 h時，提取率達到最大，為6.751 3%；當提取時間超過4.0 h后，隨著提取時間的延長，提取率減小，可能是隨著提取時間的延長，原花青素熱不穩定的成分分解［15］。綜合考慮選取提取時間4.0 h進行下一步的響應面優化試驗。

2.2.5提取次數對原花青素提取率的影響

圖6　提取次數對原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the procyanidins extraction rate

由圖6可得，隨著提取次數的增多，提取率增大；當提取次數達到3次時，提取率達到最大，為6.712 8%，之后提取率變化不大。為了節約成本故取3次作為響應面試驗提取條件。

2.3響應面試驗結果

2.3.1響應面試驗設計和結果

響應面試驗設計及結果見表2。

表2　響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到原花青素提取率與提取溫度（X1）、乙醇體積分數（X2）和料液比（X3）的二次多項回歸方程：

2.3.2響應面回歸模型方差分析

為了檢驗回歸方程的有效性，對該數學模型進行回歸方差分析顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，F值反映了各因子對響應值的重要性，F值越大（P值越?。砻髟撘蛩貙憫档挠绊懺酱?。F（X2）＞F（X1）＞F（X3），說明3個影響因子對于原花青素提取率的影響強弱順序為：乙醇體積分數＞提取溫度＞料液比。而對于顯著性，X12和X22對響應值極顯著（P＜0.000 1）；而X1、X2和X32對響應值有顯著影響（P＜0.05）。雖然3因素的交互作用對于響應值的影響沒有顯著性，但它們與響應值之間的關系并不是簡單的線性，響應值同時也受各因素的二次項的影響。模型的F值為45.49，P＜0.000 1表明該模型具有高度的顯著性，失擬項P值為0.648 2＞0.05，說明該模型失擬項不顯著，即該模型對于實驗數據的擬合度較好。模型的校正決定系數R2Adj=0.961 6，說明該模型能解釋96.16%響應值的變化，未計入回歸方程的變量對火棘果中原花青素的提取效果影響比較小。相關系數R2=0.983 2，表示該模型擬合程度良好，實驗的誤差小，可以用該模型來分析和預測火棘果原花青素的提取率［16］。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.3響應面分析與優化

根據上述回歸方程繪制出響應面分析圖，以確認提取溫度、乙醇體積分數和料液比3因素對火棘果中原花青素提取率的影響，響應面曲面和等高線見圖7。

圖7　提取溫度、乙醇體積分數和料液比交互作用對原花青素提取率影響的響應曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature，alcohol concentration and solid-liquid ratio on procyanidins extraction rate on extraction efficiency

由圖7可知，提取溫度和乙醇體積分數對原花青素的提取率影響顯著，因為提取溫度和乙醇體積分數對應的曲面較陡，料液比對原花青素提取率影響作用較弱。等高線可以反映出交互作用的強弱，提取溫度和乙醇濃度交互作用較強，因為它們交互作用的等高線圖為橢圓形，相反，其相互作用的等高線圖為圓形，故提取溫度與料液比的交互作用以及乙醇體積分數與料液比的交互作用較弱。此外，響應面均為開口向下的凸面，乙醇體積分數、提取溫度和料液比等3個因素與原花青素提取率基本呈拋物線關系，表面在試驗區域內可以找出最優值。多元回歸模型預測的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數70.60%，提取溫度70.40℃，提取料液比1∶19.24（g∶mL），該條件下綠原酸提取率預測值為5.771 7%。

2.3.4驗證試驗結果

為了檢驗響應面模型的有效性，考慮到實際操作的方便性將各因素修正為提取溫度70℃，乙醇體積分數70%，提取料液比1∶20（g∶mL），提取時間4.0 h，提取次數3次，在此修正條件下進行5次平行試驗，得出實際提取率為5.74%。驗證值與預測值相接近，說明該模型可以很好地反映出火棘果中原花青素提取條件，響應面優化回歸模型對實際工藝操作具有一定的指導意義。

3　結論

本研究在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken中心試驗設計原理及響應面分析法確定了火棘果中原花青素最佳提取工藝條件：提取溫度70℃，乙醇體積分數70%，提取料液比1∶20（g∶mL），提取時間4.0 h，提取次數3次，在此工藝條件下，測得原花青素的提取率為5.74%，與理論值相近，說明響應面法對火棘果中原花青素提取條件參數的優化是可行的，適合于提取火棘果中原花青素工業化生產。

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Optimization of extraction process of procyanidins inPyracantha fortuneanafruit by response surface methodology

WU Wei1，2，ZENG Qianlan2，XIANG Fu1，3*
（1.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；2.Medical College，Hubei Polytechnic University，Huangshi 435003，China；3.College of Life Sciences，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，China）

To optimize the extraction process of procyanidins inPyracantha fortuneanafruit，on the base of single factor experiments，the effect of extraction temperature，alcohol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and extraction times on procyanidins extraction rate was investigated by response surface methodology.The optimum extraction process of procyanidins inP.fortuneanafruit was determined.The results showed that the optimum extraction conditions were extraction temperature 70℃，ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶20（g∶ml），extraction time 4.0 h，and extraction times 3.Under this conditions，the procyanidins extraction rate was 5.74%，which was approached to the theoretical value.

response surface methodology；Pyracantha fortuneanafruit；procyanidins；extraction

R284.2

A

0254-5071（2015）10-0116-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.026

2015-09-11

大別山特色資源開發湖北省協同創新中心創新團隊項目（2015TD07）

吳偉（1979-），男，副教授，博士，研究方向為生物技術藥物。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向為天然植物資源利用。