真菌毒素在濃香型白酒生產過程中的安全性檢測

李　覓，鄧　杰，楊躍寰，衛春會*，黃治國，羅惠波，葉光斌，楊曉東，黃志瑜

（1.四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；2.江安縣工業園區管理委員會，四川江安644200；3.四川省釀酒研究所，四川廣漢610000）

真菌毒素在濃香型白酒生產過程中的安全性檢測

李覓1，鄧杰1，楊躍寰1，衛春會1*，黃治國1，羅惠波1，葉光斌1，楊曉東2，黃志瑜3

（1.四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000；2.江安縣工業園區管理委員會，四川江安644200；3.四川省釀酒研究所，四川廣漢610000）

該研究采用酶聯免疫法對濃香型白酒生產過程中的各個樣品（大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒）中的相關真菌毒素進行了定量分析。結果表明：黃曲霉毒素B1在大曲、酒醅、丟糟和黃水中的含量分別為2.55 μg/kg、1.75 μg/kg、1.95 μg/kg和2.25 μg/kg，在基酒和成品酒中的含量未達到檢出水平；赭曲霉毒素A在大曲、酒醅、丟糟和黃水中的含量分別為1.50 μg/kg、1.65 μg/kg、1.80 μg/kg和2.05 μg/kg，在基酒和成品酒中的含量未達到檢出水平；桔霉素在6種樣品中均未檢出。樣品中3種真菌毒素均未超過國家發酵食品限量標準。同時，精密度和回收率試驗結果表明，酶聯免疫法穩定性較高，適用于白酒生產過程中各個樣品的定量分析。

酶聯免疫法；真菌毒素；濃香型白酒；安全性

真菌毒素作為相關微生物的次級代謝產物，一直以來都是食品行業的安全隱患，以黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）、桔霉素（citrinin）最為常見。黃曲霉毒素B1是一種劇毒和強致癌物質，其毒性更勝于氰化鉀和砒霜，極易污染糧食作物、肉類以及奶制品等［1-2］，黃曲霉毒素的熔點較高（265～269℃），高溫條件下結晶狀態較為穩定［3］。赭曲霉毒素A廣泛存在于各種食物，谷物以及調味品、酒類等副產品中，具備強致癌、致畸和致突變性，微溶于水，極易溶于有機溶劑，對光和空氣不穩定，對腎臟和肝臟的危害性極大［4-5］。桔霉素主要由紅曲霉代謝產生，易出現在食品行業與糧食作物上，對腎臟毒性比較明顯，造成的損傷不可修復。

糧食作為白酒釀造的主要原料，被真菌毒素污染糧食極有可能進入釀酒工業，再考慮到白酒生產涉及面廣泛，包括飼料、肥料、食品、板材、曲藥等行業［6-7］，白酒行業中的真菌毒素應該引起高度重視。目前，快速檢測樣品中真菌毒素的方法較多，如薄層色譜法（thin layer chromatography，TCL）、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA）、免疫生物傳感器技術（immunobiosensor technique）、蛋白芯片技術（proteinchiptechnology）和分子印跡技術（molecularimprintingtechnology，MIT）等方法，但有的方法考慮到檢測的精確性需要借助于大型檢測儀器，如薄層色譜法和膠體金免疫層析法要借助高效液相檢測［8］，而有的方法成本高，同時對檢測條件和技術要求高，如免疫生物傳感器技術、蛋白芯片技術和分子印跡技術等方法。酶聯免疫法是在免疫酶技術的基礎上建立起來的，在疾病診斷大分子檢測中廣泛使用，在食品安全檢測污染小分子也運用廣泛［9］，特別是在調味品、葡萄酒等行業中已經成熟引入酶聯免疫法進行檢驗。該研究建立了靈敏、準確、快速、高通量的白酒真菌毒素混合污染檢測方法，不僅具有學術意義，更是符合社會白酒產品及副產物質量安全檢測的需求和應用前景，對保障白酒生產和安全消費具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樣品：成品大曲、入窖酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒，取自瀘州老窖40年窖齡窖池的樣品編號為：大曲1、酒醅1、丟糟1、黃水1、基酒1、成品酒1；來源于100年窖齡窖池的樣品編號為：大曲2、酒醅2、丟糟2、黃水2、基酒2、成品酒2。

氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、吐溫-20、二氯甲烷、甲醇、三氟乙酸等（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

酶聯免疫試劑盒、桔霉素免疫親和層析柱、赭曲霉毒素A免疫親和層析柱、玻璃纖維濾紙等：北京華安麥科生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

5430高速離心機：德國艾本德公司；SB-350型多功能高速粉碎機：上海廣沙工貿有限公司；Precellys 24高速勻質器：法國Bertin公司；AR2140電子分析天平：上海托利多儀器有限公司；BF-2000M氮氣吹干儀：北京八方世紀科技有限公司；1500酶標儀：美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1試劑的配制

黃曲霉毒素B1樣品提取液：將甲醇和去離子水按體積比2∶3混合，用于提取樣品中的黃曲霉毒素B1；

赭曲霉毒素A樣品提取液：將甲醇和去離子水按體積比8∶2混合，用于提取樣本中的OTA；

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：8 g NaCl，1.2gNa2HPO4，0.2gKH2PO4，0.2gKCl，混合用990mL蒸餾水溶解，調節pH值至7.0，定容至1 000 mL；

清洗緩沖液：25 g NaCl、5 g NaHCO3和0.1 mL吐溫-20混合，然后用蒸餾水稀釋至1 000 mL；

NaOH溶液：稱取80.0 g固體NaOH，用蒸餾水定容至1 000 mL；

三氟乙酸水溶液：取0.5 mL的三氟乙酸，用去離子水定容至1 000 mL，并用NaOH溶液調節pH至2.5；

桔霉素樣品稀釋液：取500 mL三氟乙酸水溶液，用NaOH溶液調節pH至7.5；

桔霉素洗脫液：將甲醇與三氟乙酸水溶液按體積比7∶3混合配成樣品洗脫液。

1.3.2樣品前處理

（1）黃曲霉毒素B1的提取［10］

固態樣品（大曲、入窖酒醅和丟糟）前處理：在8 mL提取液中加入1 g粉碎樣品，混合均勻（大約振蕩10 min），然后3 500 r/min常溫離心5 min，取1.28 mL上清液，用二氯甲烷提取2次，（每次用量2 mL，振蕩5 min，分層后取下層二氯甲烷相），合并二氯甲烷相；將提取步驟中得到的二氯甲烷相于50℃下氮氣濃縮吹干，加入0.2 mL甲醇，振蕩混勻，用去離子水按1∶7比例稀釋（每體積處理后溶液加入7倍體積去離子水），取稀釋后液體待測。

液態樣品（黃水、蒸餾酒、基酒和成品酒）前處理：需用樣品1 mL，直接如樣品前處理方法1中兩次二氯甲烷提取，然后將提取相于50℃下氮氣濃縮吹干，加入甲醇0.4 mL，振蕩混勻，用去離子水按1∶9比例稀釋（每體積處理后溶液加入9倍去離子水），取稀釋后液體待測。

（2）赭曲霉毒素A的提取

固態樣品前處理：將10 g粉碎樣品和20 mL提取液混合，再加入1 g NaCl，以勻質器高速攪拌2 min（1 000 r/min以上即可），4 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液并加入40 mL PBS緩沖液，用玻璃纖維濾紙過濾，得到濾液；

液態樣品前處理處理：取5 mL樣品脫氣后加入2.5 g NaCl與45 mL PBS緩沖液混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，得到濾液。

純化步驟按照國標GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》的方法進行處理［11］。

（3）桔霉素的提取

固態樣品前處理：取10 g粉碎樣品溶于20 mL樣品提取液，劇烈振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液并加入40mL樣品稀釋液，用玻璃纖維濾紙過濾，得到濾液。

液態樣品前處理處理：各取5 mL樣品液，加入45 mL樣品稀釋液，振蕩混勻后用玻璃纖維濾紙過濾、備用。

純化步驟按照SN/T 2916—2011《出口食品中桔霉素的測定方法免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》的方法進行處理［12］。

1.3.3毒素的檢測

按照各種酶聯免疫試劑盒提供的方法進行檢測。

1.3.4標準曲線的繪制與結果計算

（1）百分吸光度值的計算

百分吸光度值按以下公式計算：

式中：B為標準溶液或樣品溶液的平均吸光度值；B0為濃度為零的標準溶液的平均吸光度值。

（2）標準曲線的繪制與各樣品濃度的計算

標準曲線橫坐標為各個真菌毒素標準品濃度對數值（x），縱坐標為標準品百分吸光率（y），測定出的樣品吸光度值代入標準曲線計算各個樣品真菌毒素濃度。

1.3.5方法評價

對實驗中酶聯免疫法用于測定各樣品中真菌毒素含量的方法進行評價，以精密度和回收率為指標。

2　結果與分析

2.1標準曲線的繪制

黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A以及桔霉素的標準曲線見圖1。由圖1可知，3條標準曲線分別在相應的濃度對數值范圍內與百分吸光度值線性關系良好。

圖1　黃曲霉毒素B1（a）、赭曲霉毒素A（b）及桔霉素（c）標準曲線Fig.1 Standard curve of aflatoxin B1（a），ochratoxin A（b）and citrinin（c）

2.2各標準樣品的檢測

對黃曲霉毒素B1標準樣品、赭曲霉毒素A標準樣品和桔霉素標準樣品進行檢測，按照酶聯免疫試劑盒提供的檢測步驟，結果如表1所示。

表1　真菌毒素標準品的檢測結果Table1 Determination results of mycotoxins standard samples

根據標準品檢測要求，各標準品的變異系數＜10%符合使用要求，由表1可知，不同質量濃度的標準品變異系數均＜10%，完全符合酶聯免疫試劑盒的使用要求。

2.3各樣品中毒素的含量

2.3.1黃曲霉毒素B1的含量

分別對12個樣品進行前處理，用酶標儀測定其OD值，獲得的OD值數據用該劑盒提供的RIDAWIN軟件分析，結果如圖2所示。

圖2　不同樣品的黃曲霉毒素B1含量Fig.2 Contents of aflatoxins B1in different samples

由圖2可知，本試驗所測定的黃曲霉毒素B1在大曲中的含量分別為2.5μg/kg和2.6μg/kg，入窖酒醅中分為1.7μg/kg和1.8 μg/kg，丟糟中分別為1.9 μg/kg和2.0 μg/kg，黃水中分別為2.2 μg/kg和2.3 μg/kg，基酒和成品酒樣品中黃曲霉毒素B1的含量均＜1.0 μg/kg，低于試劑盒檢出限。國家對發酵食品中黃曲霉毒素B1的限量標準是5 μg/kg［13］。結果表明樣品中的黃曲霉毒素B1遠低于此標準，尤其是基酒和成品酒中幾乎不存在黃曲霉毒素B1。

2.3.2赭曲霉毒素A的含量

用酶標儀對處理后各個樣品的OD值進行測定，獲得的OD值數據用該劑盒提供的RIDAWIN軟件分析，結果如圖3所示。

圖3　不同樣品的赭曲霉毒素A含量Fig.3 Contents of ochratoxin A in different samples

由圖3可知，所測定的赭曲霉毒素A在大曲中的含量分別為1.6 μg/kg和1.4 μg/kg，入窖酒醅中分別為1.7 μg/kg和1.6 μg/kg，丟糟中分別為1.9 μg/kg和1.7 μg/kg，黃水中分別為2.1μg/kg和2.0μg/kg，基酒和成品酒樣中的赭曲霉毒素A含量＜0.3μg/kg，都遠低于國內外食品行業的相關標準。

2.3.3桔霉素的含量

對處理后的濃香型白酒生產過程中各個樣品進行檢測，結果均未檢出含有桔霉素，含量都低于該酶聯免疫試劑盒的最低檢出限，也從一個側面反映出了桔霉素在濃香型白酒的釀酒工業上是安全的。

2.4精密度檢測

分別對工作濃度C3（0.300 μg/kg）、C4（0.900 μg/kg）的標準品與稀釋3倍的大曲1、黃水1測定5次，所得結果如表2、表3所示。

表2　黃曲霉毒素B1測定的精密度試驗結果Table 2 Precision experiment results of aflatoxins B1

表3　赭曲霉毒素A測定的精密度試驗結果Table 3 Precision experiment results of ochratoxin A

由表2和表3可知：黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.239%～3.388%和1.052%～3.368%，精密度較好，說明該測定方法可應用于白酒釀造環節各樣品中黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的定量分析。

2.5回收率試驗

選取真菌毒素含量較高的黃水1作為試驗樣品，分別向樣品中準確添加質量濃度為0.3 μg/kg、0.9 μg/kg、2.7 μg/kg的標準品，每個質量濃度測定3次，按照測定方法進行檢測，所得結果如表4、表5所示。

表4　黃曲霉毒素B1測定的回收率試驗結果Table 4 Recovery rates experiment results of aflatoxins B1

表5　赭曲霉毒素A測定回收率試驗結果Table 5 Recovery rates experiment results of ochratoxin A

由表4和表5可知，黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A樣品加標測定的回收率分別為95.1%～97.8%和95.4%～98.4%，平均回收率分別為96.2%和96.4%，說明該測定方法的準確度較好。

3　結論

酶聯免疫法是一種利用抗原和抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的檢測技術，考慮到目前國內大多是白酒廠地處偏僻，檢測條件較差，相關技術人員較少，商品化的真菌毒素檢測試劑盒，具有特異性高、簡便快速、污染小、不需要昂貴儀器等優點［14］，特別適合于各大中小型酒廠對白酒原料、產品和副產物的檢驗，同時有利于運用白酒庫存原料和大曲中真菌毒素污染監控中大量樣本的篩檢工作。

白酒業是我國的傳統行業，歷史悠久，對國民經濟的發展發揮著十分重要的作用。因此，保證占據著我國白酒市場主導位置的濃香型白酒生產過程的安全性就顯得很有必要［15-16］。本研究通過酶聯免疫法檢測了來自瀘州老窖白酒釀造過程中各種樣品3種真菌毒素的含量，結果表明，3種真菌毒素在濃香型白酒生產過程中的含量都在國內外限量標準以內［17-18］，同時利用精密度檢測試驗和回收率試驗說明該方法可以運用于白酒生產過程中的真菌毒素的檢測。易于普及推廣為白酒行業的安全性驗證，為釀酒工業的長盛不衰奠定了堅實的基礎。

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Safety testing of mycotoxins in Luzhou-flavor liquor production

LI Mi1，DENG Jie1，YANG Yuehuan1，WEI Chunhui1*，HUANG Zhiguo1，LUO Huibo1，YE Guangbin1，YANG Xiaodong2，HUANG Zhiyu3
（1.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，China；2.Industrial Park Management Committee of Jiang'an County，Jiang'an 644200，China；3.Wine Institute of Sichuan Province，Guanghan 610000，China）

The content of related mycotoxins in Luzhou-flavor liquor samples（Daqu，fermented grains，distiller's grains，yellow water，base liquor，final product）was detected with ELISA.The results showed that the content of aflatoxins B1in Daqu，fermented grains，distiller's grains and yellow water was 2.55 μg/kg，1.75 μg/kg，1.95 μg/kg and 2.25 μg/kg，respectively；the content of ochratoxin A in Daqu，fermented grains，distiller's grains，yellow water was 1.50 μg/kg，1.65 μg/kg，1.80 μg/kg and 2.05 μg/kg，respectively.Aflatoxins B1and ochratoxin A were not detected in both base liquor and final product，while citrinin was not detected in six kinds of samples.These three kinds of mycotoxins in samples all met the National Standards of fermented food.Moreover，precision and recovery experiments demonstrated that ELISA presented good stability to apply to quantitative analysis of samples from production process of Chinese liquor.

ELISA；mycotoxin；Luzhou-flavor liquor；safety

TS262.31

A

0254-5071（2015）10-0129-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.029

2015-09-18

釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2011-10，NJ2014-16）；自貢市科技項目（2013X07，2014ZC03）

李覓（1989-），男，碩士研究生，研究方向為釀酒生物技術。

衛春會（1980-），女，高級實驗師，碩士，研究方向為發酵工程。