基于微波輔助提取八角蓮黃酮類化合物的工藝優化及抗氧化性研究

陳仕學，聶文丹，秦志亮，鐘　新

（銅仁學院 材料與化學工程學院；梵凈山特色動植物資源重點實驗室；應用化學研究所，貴州 銅仁 554300 ）

基于微波輔助提取八角蓮黃酮類化合物的工藝優化及抗氧化性研究

陳仕學，聶文丹，秦志亮，鐘新

（銅仁學院 材料與化學工程學院；梵凈山特色動植物資源重點實驗室；應用化學研究所，貴州 銅仁 554300 ）

采用單因素和正交試驗對梵凈山野生八角蓮中黃酮類化合物的提取工藝進行研究，主要考察乙醇體積分數、料液比、微波時間及微波功率4個因素對提取率的影響，結果表明：微波輔助提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分數40%、料液比1：30、微波時間4min和微波功率中低火（264w），黃酮類化合物的提取率為9.038%。另外，八角蓮黃酮類化合物對Fenton反應產生羥基自由基、鄰苯三酚自氧化反應產生超氧陰離子自由基和豬油有較高的清除能力。因此，采用微波輔助浸提法具有時間短、耗能少、含量高及抗氧化作用等特點。

八角蓮；黃酮類化合物；微波提取；工藝優化；抗氧化性

1.引言

八角蓮（Dysosma versipellis （Hance） M. Cheng ex Ying），小檗科八角蓮屬植物，湖北、貴州、廣東、等地方分布有大量該物質［1］，并有清除自由基和抗氧化活性作用［2，3］。到目前為止，對梵凈山八角蓮沒有研究報道。本文以梵凈山野生八角蓮為原料，通過微波方法提取并開展抗氧化性研究，為開發本地藥用材料打基礎。

2.器材與方法

2.1.材料

梵凈山野生八角蓮，60℃烘干，室溫保存備用。

2.2.試劑

Al（NO3）3、 FeSO4、H2O2；無水乙醇、冰醋酸Na2S2O3、三氯甲烷；NaOH；NaNO2、乙酸乙酯；水楊酸；鹽酸；Tris；鄰苯三酚。

2.3.儀器

恒溫干燥、MM823EC8-PS（X）型美的微波爐、800型低速離心機、AR1140型電子天平、粉碎機、分光光度計。

2.4.方法

2.4.1.制作標準曲線

取10mg蘆丁，30%乙醇溶液溶解，用容量瓶定溶到100mL刻度，攪拌均勻，得到0.1mg/mL標準溶液。分別取標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于10mL容量瓶中，加5g/100mL亞硝酸鈉1.0mL，放置5min，加10g/100mL硝酸鋁1.0mL，放置5min，再加4g/100mL氫氧化鈉5mL，搖勻，放置10min，定容 100mL。用質量濃度作橫坐標，吸光度作縱坐標，作標準曲線［4］。

2.4.2.含量測定。

稱取藥材粉，溶解加熱提取，濾液倒入100mL容量瓶，在瓶中加入1.0mL 5%的亞硝酸鈉溶液，放置一會兒；加1.0mL 10%硝酸鋁溶液，放一會兒，再加 5.0mL 4%L氫氧化鈉溶液，然后用蒸餾水加到100mL，震蕩，放10min測定，計算該物質含量。

2.4.3.提取條件的優化

2.4.3.1.單因素實驗

分別準確稱取已處理好的八角蓮粉末 1.0000g，以乙醇為浸提劑進行單因素試驗，料液比1：10，1：20，1：30，1：40，1：50；微波時間3、4、5、6、7、8min；乙醇濃度20%、30%、40%、50%、60%；功率設置為低火、中低火、中火、中高火、高火做單因素試驗。

2.4.3.2.正交試驗

由于各單因素影響不同，因此需對單因素通過正交試驗得到最佳浸提條件。

2.4.4.抗氧化活性研究

2.4.4.1.?OH自由基清除率的測定［5］

取7個25mL容量瓶編號為1、2、3、4、5、6、7。依次加入2mmol/LFeSO4溶液5mL、6mmol/L水楊酸-乙醇15mL。向1號加2mL蒸餾水，向2-7號分別加濃度不同的2mL黃酮類化合物，然后在1-6號中加5mL 3%雙氧水，7號加5mL蒸餾水，40℃水浴加熱25min。測吸光度。

清除率（%）=（A0—（Ax—Ax0））/A0×100%，式中：A0表示空白吸光度；Ax表示加待測溶液后的吸光度；Ax0表示待測溶液本底吸光值。

2.4.4.2.·O2-清除率的測定

取7個50mL容量瓶編號為1、2、3、4、5、6、7。依次加入0.05mol/LTris-HCl 5mL，37℃水浴加熱20min。1號加2mL蒸餾水，2到7號分別加入濃度不同樣品溶液 2mL，1-6號加 3mmol/L鄰苯三酚0.5mL，7號加入0.01mL/L 鹽酸0.5mL，將1-7號同時放于37℃水浴加熱6min，加入0.1mol/L鹽酸1mL，在320nm處測其吸光值［6-7］。

清除率（%）=（A0-（Ax-Ax0））/A0×100%，式中：A0表示空白吸光度；Ax表示加待測溶液后吸光度；Ax0表示待測溶液本底吸光值。

2.4.4.3.POV值的測定

取1mL豬油于250mL碘量瓶中，加入不同體積的黃酮類化合物提取液，于 60℃恒溫干燥箱保溫48h，取出加入氯仿-冰乙酸（2：3）混合液20mL，震蕩，加1mL飽和碘化鉀使之溶解，震蕩均勻，密封、暗處保存 5min，立刻加蒸餾水 25mL，搖均勻，Na2S2O3滴至淡黃色，加1mL 1%淀粉作指示劑，至藍色消去，記錄體積 V1，同法作空白實驗，消耗Na2S2O3體積為V0［8］，計算POV值。

式中：V1表示樣品消耗 Na2S2O3的體積（mL）；V2表示空白消耗Na2S2O3的體積（mL）；M：1mL豬油的質量（1mL豬油相當于0.6g）。

3.結果與分析

3.1.蘆丁標準曲線的制作

由2.4.1.的方法得到的標準曲線方程為：Y=0.084C-0.004（R2=0.999），二者呈良好的線性關系（見圖1）。

圖1　蘆丁標準曲線

提取率Y（%）=C×V/M，

式中：Y表示提取率（%）；C表示待測樣含量（mg/mL）；V為提取液的體積（mL）；M為樣品質量（g）。

3.2.單因素實驗

3.2.1.乙醇體積分數的影響

由圖 2不難看出，開始時提取率與體積分數關系變化不大，到 40%時，提取率為最高值，以后隨之下降。原因是與微波作用原理有一定關系，即是增加乙醇體積分數可以使原料充分溶解；但是乙醇體積分數如果太高，又會使細胞內醇溶性雜質溶出，導致提取率下降［9］。因此，選擇40%作為最佳條件。

3.2.2.料液比的影響

由圖3看出，開始料液比增大提取率緩慢增加，到達1：30的時候提取率為最大，大于1：30，會逐漸降低。是因為料液比加大利于有效成分充分溶出，進而提高了得率，比例加大反而使細胞不能完全破裂，不能充分溶出有效成分，綜合考慮［10］，選擇1：30作為最佳值。

圖2　乙醇體積分數的影響

圖3　料液比的影響

圖4　浸提時間對提取率的影響

圖5　功率的影響

3.2.3.浸提時間的影響

由圖 4得到，隨著時間加長，提取顯著加大，5min時，達最佳值，并隨時間加長反而降低，可能原因是時間短，微波作用不全，有效成分溶出不多，導致得率也不高，總黃酮得率也相應提高，但隨著時間進一步延長，細胞膜破碎，從而影響提取效果［11-12］。另外，時間長，溫度會上升，使有效成分遭到破壞并分解［13-14］，因此，應選擇5min為最佳時間。

3.2.4.功率的影響

由圖5得知，隨著功率加大，提取率有所增加，在264w時，提取率為最大值，并隨著功率加大而降低，若要達到相應的提取率，采用低火加熱時需要較長的微波輻射時間，采用中火加熱，十分容易爆沸，嚴重影響提取效果［15］。因此，選擇264w為最佳值。

3.3.正交實驗結果及分析

由于各因素影響不一，為了更好確定影響情況，對各單因素進行正交試驗，得到最佳提取工藝，結果見表1和表2。

由表2得到，對其影響因素順序是D＞A＞B＞C，因此得到最優條件是A2B2C1D2，即體積分數40%、1：30為料液比、4min為最佳浸提時間、功率為中低火（264w）。

3.4.驗證性實驗

為了檢驗最佳工藝條件是否穩定，利用最佳工藝條件重復操作5次，測提取率，計算RSD值，實驗結果如表3。

由表 3得出，黃酮類化合物平均提取率為9.038%，比正交試驗中的最佳值均大，計算得出RSD 為0.68%，由此表明該提工藝是比較穩定的。

3.5.不同產地八角蓮黃酮類化合物的提取率比較

分別稱取不同產地八角蓮1g在最佳條件下提取黃酮類化合物，測定吸光值，通過回歸方程計算提取率，結果見表4。由表4得到，產地不同，其提取率有一定差異，且梵凈山野生八角蓮黃酮類化合物提取率比其他地方的稍微較高。

3.6.抗氧化性研究

3.6.1.羥基自由基清除

由圖 6可知，該化合物對羥基自由基有一定清除作用，隨著濃度的增加清除作用也增大。

表1　因素水平表

表2　正交試驗結果

表3　驗證實驗結果

表 4 不同產地八角蓮黃酮類化合物的提取率比較

圖6　八角蓮黃酮類化合物?OH自由基的清除能力

3.6.2.超氧陰離子的清除

由圖 7可知，鄰苯三酚在堿性情況下自氧化迅速，放出·O2-，當加清除劑后容易清除·O2-，使得鄰苯三酚自氧化速度顯著降低。由此看出，該文章對鄰苯三酚自氧化有很好抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用加大。

圖7　八角蓮黃酮類化合物對·O2-的清除能力

3.6.3.POV值測定

由圖8可知，隨該物質含量增加POV值逐漸減小，POV值小對豬油有氧化抑制作用，POV值越小對豬油有氧化抑制有增強的趨勢。初期趨勢明顯，隨后趨勢越小，總之，該物質對豬油有極好的抗氧化活性。

圖8　POV值測定

4.結論

通過正交分析得出最佳工藝條件：乙醇濃度30%，料液比1：40g/mL，最佳時間4min，功率264w。此條件下，對貴州不同產地八角蓮黃酮類化合物提取，其提取率有所差異，梵凈山的稍偏高；并檢驗抗氧化活性，結果為：八角蓮黃酮類化合物對·OH 和·O2-均具有清除作用，通過測定 POV值，得知對豬油氧化有抑制作用，并與含量有關系。

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Study on Microwave Extraction Process Optimization and Anti-oxidative Activity of Flavones from The Wild Dysosma Versipellis

CHEN Shi-xue，NIE Wen-dan，QIN Zhi-liang，ZHONG Xin
（School of Material and Chemical Engineering，Tongren University； Key Laboratory of Special Animal and Plant Resource in Fanjing Mountain； Institute of Applied Chemistry，Tongren，Guizhou 554300，China ）

The extraction conditions were approached by single factor and orthogonal test for the flavonoids from Dysosma versipellis. The results showed that the optimum extracting conditions were ethanolvolume fraction 40%，solid -liquid ratio 1：30 g/mL，microwave time 4min and microwave power 264w. The flavonoids yield reached 9.038%. In addition，the flavonoids of Dysosma versipellis could scavenge hydroxyl free radical formed in Fenton reaction，Oxygenfree radicals of self oxidation of pyrogallol and lard. Therefore，microwave assistance could be in possession of shorter time，lower energy. Improving efficiency and the oxidation resistance was stronger and high removal capacity of flaovues from Dysosma versipellis.

Dysosma versipellis，flavonoids，microwave extraction，process optimization，anti-oxidative activity

O652

A

1673-9639 （2015） 04-0019-05

（責任編輯 徐松金）（責任校對 毛志）（英文編輯 田興斌）

2015-06-22

本文系貴州省科學技術基金項目（黔科合LH字［2014］7493），銅仁學院院級學生項目（trxyS1351），貴州省教育廳基金項目“梵凈山特色動植物資源保護與利用重點支持學科”（黔教合KY（2011）005）成果。

陳仕學（1976-），女，貴州銅仁人，副教授，碩士，研究方向：生化分離及天然藥物研究。