微酸環境響應的聚天冬氨酸修飾脂質體的制備與表征

王麗琳，沈驤一，蘇海佳，曹輝

?

微酸環境響應的聚天冬氨酸修飾脂質體的制備與表征

王麗琳，沈驤一，蘇海佳，曹輝

（北京化工大學北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029）

利用帶負電的聚天冬氨酸分子與部分帶正電的磷脂雙分子層之間的靜電吸附作用，通過“一步法”成功制備了聚天冬氨酸（PASP）修飾脂質體（PLPs），實現了修飾脂質體微酸環境響應性。將脂質體制備與PASP修飾同時完成的“一步法”大大簡化了制備工藝，提高了脂質體（PLPs）的制備效率。通過單因素篩選確定了pH敏感性顯著的修飾脂質體制備條件，即外水相溶液PASP濃度2.5%（質量分數），pH8.5。透射電子顯微鏡照片顯示PLPs由于修飾劑的存在具有更大的粒徑，且表面電負性高，證明了“一步法”成功制備了pH敏感性修飾脂質體。

pH敏感；聚天冬氨酸；脂質體；制備；納米粒子

引 言

腫瘤是一種極大危害人類健康的疾病。多年來人們一直致力于開發高效抗腫瘤藥物，發現并推廣使用了諸如羥基喜樹堿[1]、紫杉醇[2]、萊菔硫烷[3]等新一代抗腫瘤藥物。然而在研究中發現，多數藥物分子為非選擇性分子，進入人體后會廣泛分布于各器官組織，在抑制腫瘤細胞的同時會抑制正常細胞的生長，引起病人的極大痛苦[4]。因此，針對傳統給藥方式存在的局限性，越來越多研究者著重于藥物遞送系統(drug delivery system)[5]的研究，包括口服藥物釋放系統、透皮藥物釋放系統、黏膜藥物釋放系統、靶向藥物釋放系統、細胞微囊化藥物釋放系統[6]等，其中，靶向藥物釋放系統能夠有效地將藥物運送至病變區[7]，降低給藥劑量、避免抗腫瘤藥物對正常組織的危害。脂質體是一種人工制備的生物膜類似物，由脂類雙分子層組成，主要成分是磷脂和膽固醇，易與細胞膜融合并完成細胞內吞作用[8]，具有生物降解性和緩釋性，可降低藥物的毒性、提高藥物的穩定性[9]，因此成為新型的藥物載體廣泛應用于抗腫瘤藥物的靶向釋放[10]。脂質體制備方法繁多，早期對于脂質體制備的摸索停留在改變有機相與水相接觸方式以及蒸出方式上，形成了物理分散法、兩相分散法等傳統方法[11-12]。傳統方法的優點是對設備要求低、制作方便；缺點是粒徑和結構難以控制且難以規模化制備。隨著研究的不斷深入和人們對脂質體產品的需求增加，可制備出粒徑可控、結構可控的脂質體的微流體法[13]、超臨界流體法[14]等應運而生。目前脂質體作為抗腫瘤藥物載體的主要研究目標是提高其靶向性和穩定性。為起到靶向治療的目的，長循環脂質體[15]、溫度敏感脂質體[16]、pH敏感脂質體[17]、磁性脂質體[18]、免疫脂質體[19]等新型脂質體被陸續研制出來。其中，pH敏感脂質體可通過在脂質體表面修飾具有pH響應性的分子得到[20]。腫瘤細胞生長于微酸性間質液中（pH約為5.0），用于制備腫瘤靶向藥物載體的修飾分子必須可響應pH7.4～pH5.0的微弱酸性變化，這樣才能達到藥物在腫瘤組織中快速大量釋放、在正常組織的生理環境中少量釋放的目的。目前已有研究顯示表面活性劑類物質[21]、聚丙烯酸及其衍生物[22]制備的修飾脂質體可以起到響應微酸環境的作用，但上述修飾分子自身生物相容性不高，容易對正常機體造成傷害。

聚天冬氨酸（PASP）是一種含有豐富—COO-基團的陰離子型生物大分子，pa=4.88，處于弱酸性環境中即可發生構象變化[23]。由于其具有良好的生物相容性、水溶性以及pH敏感性，在藥物遞送領域有著巨大的前景[24]。本文制備脂質體的主要成分大豆卵磷脂中含有相當一部分的磷脂酰膽堿，其頭部的—N+基團帶正電，理論上PASP可通過靜電吸附作用自發組裝到脂質體表面。若將PASP修飾于脂質體表面，當PASP修飾脂質體（PLPs）處于pH5.0左右的腫瘤組織病灶環境中，PASP會發生鏈收縮效應，扯斷與之相連接的脂質體，造成藥物釋放，而當PLPs處于正常組織生理環境中時，PASP鏈維持舒展的構象，則PLPs結構保持完整，僅發生少量藥物釋放。長久以來，修飾脂質體的制備遵循“脂質體形成-脂質體修飾”兩步進行，修飾過程需要經過1～2 h的水合過程[25]才能完成，制備效率不高。

本文將針對兩步制備修飾脂質體工藝煩瑣的問題，提出脂質體形成-修飾同時完成的一步制備法。該“一步法”用修飾劑PASP溶液代替復乳法中的外水相緩沖液，制備出響應弱酸性環境發生藥物快速釋放的脂質體。此外，考慮到PLPs的pH敏感性來源于PASP，因此外水相PASP溶液的濃度及pH必然會影響PLPs的pH敏感性，本文將研究影響pH敏感性的條件，以測試不同pH環境中的藥物釋放性能為手段，從而確定PASP修飾脂質體外水相PASP的最佳濃度及pH。

1 實 驗

1.1 實驗試劑與儀器

大豆卵磷脂（純度≥98%），北京奧博星生物技術有限責任公司；膽固醇（純度≥99%），北京奧博星生物技術有限責任公司；乙醚（分析純）、NaCl（分析純）、Na2HPO4(分析純)、NaH2PO4（分析純），北京化工廠；阿糖胞苷（分析純），車頭制藥廠；硫酸魚精蛋白（分析純），Sigma；Triton X-100（10%），Sigma；本文實驗中所述PASP皆為實驗室自制。

電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9076A型，上海精宏實驗設備有限公司；水浴恒溫磁力攪拌器，SHA-A，金壇市華峰儀器有限公司；全波長酶標儀，Thermo absystems，Multiskan Spectrum公司；旋轉蒸發儀，RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；高速離心機，TGL-16G，上海安亭科技儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 pH敏感脂質體的制備 “一步法”制備pH敏感脂質體，具體方法見文獻[26]。

“分步法”制備pH敏感脂質體：精密稱取卵磷脂48 mg，膽固醇12 mg，加入2.5 ml乙醚充分溶解。置于旋轉蒸發儀0.02 MPa、25℃旋蒸30 min，注入阿糖胞苷水溶液1 ml，超聲至形成乳液。加入2.5%（質量分數，下同）的PASP水溶液充分搖勻，30℃水合40 min，置于截留分子量3500的透析袋中透析除去未包封的小分子藥物，即得[26]。

1.2.2 pH敏感脂質體的工藝優化 外水相PASP溶液濃度對修飾脂質體pH敏感性的影響。以“一步法”制備修飾脂質體，PASP溶液濃度為1.5%、2%、2.5%、3%。采用文獻[26]所述反透析法測定pH敏感性以確定制備修飾脂質體的最佳PASP濃度。

外水相PASP溶液pH對修飾脂質體pH敏感性的影響。以“一步法”制備阿糖胞苷脂質體。PASP溶液pH分別為8.0、8.5、9.0、9.5。采用文獻[26]所述反透析法測定pH敏感性以確定制備修飾脂質體的最佳外水相pH。

1.2.3 修飾脂質體的理化性質表征 修飾脂質體的透射電子顯微鏡觀察。“一步法”制備LPs和PLPs：精密吸取制好的脂質體樣品各10ml，以微量可調移液器小心滴加在銅網上，置于透射電鏡下200 kV電壓下觀察。

修飾脂質體的表面電荷和粒度分析。“一步法”制備LPs、PLPs，并分別稀釋成質量摩爾濃度為0.005 mol·kg-1的溶液，于激光粒度分布儀中測定zeta電位及粒度分布。

2 結果與討論

2.1 pH敏感修飾脂質體的“一步法”制備方法

圖1為利用“分步法”與“一步法”分別制備的PLPs在不同酸堿性環境中的藥物釋放曲線。由圖所示，“分步法”制得的修飾脂質體在微酸環境中（pH=5.0）釋放緩慢，在生理pH環境中（pH=7.4）釋放快速，與微酸性響應的藥物載體的要求相反，無法得到微酸性環境響應的PASP修飾脂質體。這可能是由于長鏈PASP難以與已經閉合為囊泡的磷脂頭部發生靜電吸附作用，pH敏感性的PASP分子無法與脂質體結合造成的。而“一步法”制備的PLPs在微酸性環境中（pH=5.0）6 h內釋放完全，而相同時間內在正常生理環境下（pH=7.4）釋放79.4%，實現了在微酸環境中快速釋放的目的。這是因為“一步法”采用充分去質子化的PASP水溶液直接作為外水相，能夠提供PASP中的電負性—COO-基團與正電性膽堿基團充分接觸的機會。“一步法”保證了脂質體的形成和修飾過程一次性完成。PLPs的特點顯示其具有成為腫瘤靶向藥物載體的潛力。

2.2 修飾脂質體的pH敏感性優化

2.2.1 外水相溶液（PASP）濃度對修飾脂質體pH敏感性的影響 外水相PASP的濃度直接影響脂質體的修飾程度，從而改變pH敏感性和釋放時間。由圖2所示，外水相（PASP）濃度對PASP修飾脂質體的pH敏感性影響較大。在相同時間內（4 h），當外水相濃度為2.5%時，PLPs在pH5.0環境中藥物釋放超過85%，顯著高于在pH7.4環境中52.4%的釋放，這種釋放量的差異性顯著高于其他濃度PASP溶液制備的PLPs。PLPs對微酸環境的響應性取決于pH敏感性分子PASP在脂質體表面的實際修飾程度。當PASP溶液濃度低于2%時，PLPs中pH敏感性分子不足，無法表現出pH敏感性。當PASP濃度升高至3%時PLPs的pH敏感性回落，這是因為PASP濃度過高，聚合物PASP長鏈可能在溶液中形成折疊或螺旋構象，分子間也會產生位阻，不利于與脂質體靜電吸附。因此，PLPs的pH敏感性與PASP的濃度并非線性關系，當PASP濃度為2.5%時，PLPs體現出最強的pH敏感性，如圖3所示，此時PLPs在整個釋放周期內pH敏感性顯著，6 h內藥物在微酸環境總釋放完全而在正常生理環境中釋放不超過60%，適于用作腫瘤靶向的藥物載體。

2.2.2 外水相溶液（PASP）pH對修飾脂質體pH敏感性的影響 PASP能與脂質體靜電吸附結合的先決條件是外水相溶液中的PASP能夠電離出足夠的電負性—COO-基團。為使弱電解質PASP充分解離出—COO-以便與磷脂分子的親水頭部靜電吸附結合，實驗中均調節外水相PASP的pH為堿性。由圖4所示，當外水相pH為8.0～8.5時，PLPs表現出對于微酸性環境的pH敏感性，藥物釋放快速。說明當pH達到8.0及以上時，弱電解質PASP 已發生充分的電離。當外水相pH提高至9.0時PLPs在酸性環境和正常生理環境中的藥物釋放十分接近而不能滿足pH敏感性藥物載體的要求；將外水相溶液的堿性繼續提高至pH9.5時，其pH敏感性甚至發生反轉，可能是因為外水相中過量的堿加入會破壞脂質體囊泡的滲透壓平衡，加速脂質體的作用而使pH敏感性失效。綜上所述，僅當pH8.5時，PLPs有較好的pH敏感性，圖5顯示此時的PLPs在釋放結束時pH5.0環境中藥物累計釋放率在90%以上，效果理想。

2.3 修飾脂質體的理化性質表征

2.3.1 修飾脂質體的形態觀察 如圖6所示，電鏡下觀察到LPs、PLPs皆分散良好，電鏡下大致呈圓形。其中，普通脂質體直徑約100 nm，而PLPs由于表面連接了高分子物質而使粒徑增大至200 nm。透射電子顯微照片從直觀上論證了PASP分子可通過“一步法”有效修飾于脂質體表面。

2.3.2 修飾脂質體的表面電性與粒度分析 zeta電位能夠反映膠體分散系的帶電程度，還可以表示微粒的分散程度。LPs和PLPs的zeta電位和粒度分析測定值見表1。一般認為，zeta電位的絕對值在30 mV以上可以認為體系中微粒之間的作用以排斥力為主，不易聚沉。從表1中可以看出，LPs和PLPs 都是穩定的膠體體系。PASP鏈負電性基團豐富，因而PLPs的zeta電位值均高于LPs。表1顯示的粒度分析變化趨勢與zeta電位變化趨勢相吻合，表明脂質體的理化性質與其表面是否具有修飾分子相關，再次證明了“一步法”制備pH敏感性修飾脂質體應用成功。

表1 兩種脂質體的平均粒度與zeta電位Table 1 Mean size and zeta potential of two kinds of liposomes

3 結 論

本文成功運用“一步法”制備了pH敏感性顯著的聚天冬氨酸修飾脂質體（PLPs）。實驗結果表明，PLPs的pH敏感性強弱與PASP溶液濃度和pH有關，隨PASP濃度和pH增大呈現先增加后減小趨勢，當溶液濃度2.5%、pH為8.5時pH敏感性最佳。透射電鏡下觀察與粒度分布顯示PLPs粒徑高于LPs，同時zeta電位測試顯示PLPs表面電負性強于LPs，兩項理化性質測試表明“一步法”可以將電負性大分子PASP修飾于脂質體表面，成功制備了pH敏感性修飾脂質體。

References

[1] Chen Fei(陳菲), Wang Yumei(王瑜梅). Effect of hydroxycamptothecin on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7 [J].(中國醫藥導報), 2011, 8(10): 17-19

[2] Feng Xia(馮霞), Liang Shile(梁世樂), Li Xiaofeng(李曉峰),. Preparation and antitumor effect of drug delivery system of taxol conjugated to polyethylene glycol [J].()(化工學報), 2003, 54(2): 209-214

[3] Danhier F, Feron O, Préat V. To exploit the tumor microenvironment: passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery [J]., 2010, 148(2): 135-146

[4] Jansen L, Koch L, Brenner H,. Quality of life among long-term (≥5years) colorectal cancer survivors-systematic review [J]., 2010, 46(16): 2879-2888.

[5] Wu Qu(武曲), Huo Meirong(霍美蓉), Zhou Jianping(周建平). Advances on novel drug system [J].(中國藥科大學學報), 2013, 44(2): 97-104

[6] Liu Xiudong(劉袖洞), Ma Xiaojun(馬小軍), Yuan Quan(袁權). Drug delivery systems [J].()(化工學報), 2005, 56(6): 955-961

[7] Brewer E, Coleman J, Lowman A. Emerging technologies of polymeric nanoparticles in cancer drug delivery [J]., 2011, 2011: 1

[8] Xu Wen(徐雯), Pan Jun(潘俊). The research progress of ligand-grafted liposomes [J].(國外醫藥: 合成藥. 生化藥. 制劑分冊), 2002, 23(5): 293-297

[9] Ji Junmin(紀俊敏), Xie Wenlei(謝文磊). The research progress of liposomes as a drug carrier [J].(鄭州工程學院學報), 2002, 23(4): 68-72

[10] Duan Kangying(段康穎), Wang Congrong(王從容),Li Qi(李琦). The new drug carrier — liposomes [J].(中國醫院藥學雜志), 2010, 30(10): 864-866

[11] Wang C Y, Hughes K W, Huang L. Improved cytoplasmic delivery to plant protoplastspH-sensitive liposomes [J]., 1986, 82(1): 179-184

[12] Quan Dongqin(全東琴), Su Desen(蘇德森). Studies on the preparation and characteristics of empty proliposomes as a drug carrier [J].(沈陽藥科大學學報), 1999, 16(3): 160-163

[13] Jahn A, Vreeland W N, Gaitan M,. Controlled vesicle self-assembly in microfluidic channels with hydrodynamic focusing [J]., 2004, 126(9): 2674-2675

[14] Meure L A, Foster N R, Dehghani F. Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes: a review [J]., 2008, 9(3): 798-809

[15] Wang F, Shen Y, Xu X,. Selective tissue distribution and long circulation endowed by paclitaxel loaded PEGylated poly(-caprolactone-co-l-lactide) micelles leading to improved anti-tumor effects and low systematic toxicity [J]., 2013, 456(1): 101-112

[16] Chen C Y, Kim T H, Wu W C,. pH-dependent, thermosensitive polymeric nanocarriers for drug delivery to solid tumors [J]., 2013, 34(18): 4501-4509

[17] Huang Y, Yu H, Xiao C. pH-sensitive cationic guar gum/poly(acrylic acid) polyelectrolyte hydrogels: swelling anddrug release [J]., 2007, 69(4):774-783

[18] Pradhan P, Giri J, Banerjee R,Preparation and characterization of manganese ferrite-based magnetic liposomes for hyperthermia treatment of cancer [J]., 2007, 311(1): 208-215

[19] Yang X, Li Y, Li M,. Hyaluronic acid-coated nanostructured lipid carriers for targeting paclitaxel to cancer [J]., 2013,334(2): 338-345

[20] Felber A E, Dufresne M H, Leroux J C. pH-sensitive vesicles, polymeric micelles, and nanospheres prepared with polycarboxylates [J]., 2012, 64(11): 979-992

[21] Zhang Y, Rong Qi X, Gao Y,. Mechanisms of co-modified liver-targeting liposomes as gene delivery carriers based on cellular uptake and antigens inhibition effect [J]., 2007, 117(2): 281-290

[22] Mignani S, El Kazzouli S, Bousmina M,. Expand classical drug administration ways by emerging routes using dendrimer drug delivery systems: a concise overview [J]., 2013, 65(1): 1316-1310

[23] Zhao Y, Su H, Fang L,. Superabsorbent hydrogels from poly (aspartic acid) with salt-, temperature- and pH-responsiveness properties [J]., 2005, 46(14): 5368-5376

[24] Cheng Daming(成大明), Chen Qiang(陳強), Zhu Aiping(朱愛萍),Progress in research on poly( aspartic acid ) and its derivatives [J].(材料導報), 2007, 16(7): 60-63

[25] Xu Yunlong(徐云龍), Jiang Houyou(姜厚友), Qian Xiuzhen(錢秀珍), Ma Xinsheng(馬新勝). Preparation and properties of pH-sensitive doxorubicin nanoliposomes [J].(華東理工大學學報), 2008, 34(3): 364-368

[26] Su Haijia(蘇海佳), Wang Lilin(王麗琳), Tan Tianwei(譚天偉). Preparation of a pH-sensitive modified liposomes[P]: CN, 103585106A. 2014-02-19

Preparation and characterization of subacid environment responsive polyaspartic acid modified liposomes

WANG Lilin，SHEN Xiangyi，SU Haijia，CAO Hui

Beijing Key Laboratory of BioprocessBeijing University of Chemical TechnologyBeijingChina

PASP modified liposomes (PLPs) were prepared by using negatively charged PASP chains linked to the head of positively charged phospholipidelectrostatic adsorption. A “one-step” method was developed to form and modify the liposomes. Single factor experiments were conducted to prepare high pH sensitive PLPs. The optimal formula in preparing PLPs was 2.5%(mass) PASP solution with pH8.5. TEM results showed that PASP modified liposomes had a larger particle size and their surface with higher electro-negativity. PASP modified liposomes are a kind of relatively stable emulsion system.

pH sensitivity；polyaspartic acid；liposomes；preparation；nanoparticles

2014-09-15.

Prof. SU Haijia, suhj@mail.buct.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141374

R 944.1

A

0438—1157（2015）03—1234—06

國家重點基礎研究發展計劃項目（2014CB745100）；國家高技術研究發展計劃項目(2012AA021402)；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目(LXJJ2012-001)。

2014-09-15收到初稿，2014-11-28收到修改稿。

聯系人：蘇海佳。第一作者：王麗琳（1989—），女，碩士研究生。

supported by the National Basic Research Program of China (2014CB745100), the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA021402) and the Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM (LXJJ2012-001).