乙二胺四乙酸驅鎘對慢性鎘中毒大鼠、小鼠的腎毒性

李光先， 鐘志勇， 陳嘉興， 余日安， 唐小江

（1. 廣東藥學院公共衛生學院， 廣州 510310； 2. 廣東省醫學實驗動物中心， 南海 528248）

乙二胺四乙酸驅鎘對慢性鎘中毒大鼠、小鼠的腎毒性

李光先1，2， 鐘志勇2， 陳嘉興1，2， 余日安1， 唐小江2

（1. 廣東藥學院公共衛生學院， 廣州 510310； 2. 廣東省醫學實驗動物中心， 南海 528248）

目的探討乙二胺四乙酸（EDTA）治療慢性鎘中毒動物模型毒副作用。方法將雄性SD大鼠、雄性NIH小鼠分別隨機分為空白對照組和模型組。模型組腹腔注射CdCl2+ β-巰基乙醇（ME）的混合液，每日一次，連續5 d，末次染毒50 d及30 d后分別隨機分為模型對照組和EDTA治療組。空白對照組和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組按體質量腹腔注射EDTA溶液，實驗結束后均采集動物的尿液、血液腎臟及睪丸組織，檢測體內Cd和組織病理檢查。結果實驗結束時，EDTA組大鼠、小鼠的腎臟Cd、尿Cd和血Cd含量明顯高于模型對照組（P＜0.05），并見腎小管蛋白質沉淀。結論EDTA會引起體內的鎘向腎臟富集，不宜用于慢性鎘中毒驅鎘。

慢性鎘中毒； 二胺四乙酸（EDTA）； 腎毒性

鎘是人類確定致癌物和腎毒物。根據環保部和國土資源部公報， 我國約有7%的土壤存在不同程度的鎘污染［1］。鎘超標和鎘中毒事件頻發， 成為社會關注的熱點［2，3］。鎘進入機體后逐漸在腎小管細胞內富集， 影響鈣重吸收， 導致骨質疏松、腎衰竭和癌癥等慢性危害［4］。有學者認為， 二硫代氨基甲酸類、氨羧類以及巰基類絡合劑有驅鎘作用并已用于臨床研究， 但大量研究結果表明其對慢性鎘中毒無效或存在毒副作用， 因此目前沒有特效驅鎘解毒藥［5，6］。有人主張使用二胺四乙酸（EDTA）進行體內驅鎘， 但其安全性與有效性一直有爭議［7-9］。為此， 本文旨在通過體內實驗探討EDTA對大、小鼠慢性鎘中毒的驅鎘效果及其副作用， 為驅鎘藥物的研發提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性SD大鼠20只， 體質量180±14 g；SPF級雄性NIH小鼠30只，體質量17±5 g，均購自廣東省醫學實驗動物中心［SYXK（粵）2013-0002］，飼養于廣東省醫學實驗動物中心比較醫學實驗室［SYXK（粵）2013-0002］。飼養條件：溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，10～14 h晝夜間斷照明。動物實驗經廣東省醫學實驗動物中心實驗動物福利和倫理委員會批準。

1.2主要試劑和儀器

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）購于天津市福晨化學試劑廠，批號：20081012； β-巰基乙醇（ME），Sigma公司，批號：M6250；EDTA由天津市福晨化學試劑廠提供，批號：130224。 BS224S電子天平（德國Sartorius 公司）； SET6040恒溫電熱板（深圳帆與航電子科技有限公司）； 全自動生化分析儀（ECHO，意大利Logotec公司）； 石墨爐原子吸收光譜儀（型號: ZEENIT700，德國Analytikjena公司）； 輪轉切片機（德國LEICA公司 RM2135）； 生物組織全自動脫水機、生物組織包埋機及冷凍機和生物組織全自動染色機（湖北孝感醫用儀器有限公司 TS-12C、BM-VII、RS-18）； 正置顯微鏡（Olympus BX41），病理圖像分析系統（Image-Pro Express 5.1.1.14）。

1.3動物實驗方法

1.3.1EDTA對大鼠慢性鎘中毒模型的驅鎘試驗將20只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組（8只）和模型組（12只）。模型組大鼠腹腔注射3 μmol/kg CdCl2+60 μmol/kg β-巰基乙醇（ME）的混合液［10］，每日1次， 連續5 d， 末次染毒50 d后隨機分為模型對照組（6只）和EDTA治療組（6只）。空白對照組和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組按體質量腹腔注射187.1 mg/kg的EDTA溶液， 每周5次， 連續3周； 試驗期間每周稱量體質量1次。按1.4采集尿液、血液及腎臟，檢測體內Cd和組織病理檢查。

1.3.2EDTA對小鼠慢性鎘中毒模型的驅鎘試驗將30只雄性NIH小鼠隨機分成空白組（10只）和模型組（20只）。模型組小鼠腹腔注射6 μmol/kg CdCl2+ 120 μmol/kg ME混合液［11］，每日1次，連續5 d，末次染毒30 d后隨機分為模型對照組（10只）和EDTA治療組（10只）。空白對照組和模型對照組腹腔注射生理鹽水； EDTA治療組腹腔注射93.6 mg/kg 的EDTA溶液，每周5次，連續4周； 試驗期間每周稱量體質量1次。按1.4采集尿液、血液及腎臟，檢測體內Cd和組織病理檢查。

1.4樣品采集與鎘含量檢測

1.4.1樣品采集與處理試驗結束前1 d，用代謝籠收集動物24 h尿液，分別取1 mL采用生化分析法測定尿肌酐含量和1 mL用于檢測尿鎘。隨后經動物眼眶靜脈叢采血1 mL于加有1%肝素鈉30 μL的抗凝管中。用二氧化碳窒息法處死動物， 采集動物的腎臟和睪丸組織取其中一部分稱重后， 用5 mL濃硝酸+2 mL過氧化氫+0.5 mL高氯酸進行熱消化，定溶于10 mL比色管； 取另一部分腎臟和睪丸組織以質量分數4%甲醛溶液固定做病理學檢查。

1.4.2鎘含量檢測血鎘、尿鎘和腎、睪丸鎘采用石墨爐原子吸收光譜法測定［12，13］，

1.5統計分析

圖1　EDTA治療慢性鎘中毒大鼠的體質量變化

圖2　EDTA治療慢性鎘中毒小鼠的體質量變化

2　結果

2.1動物體質量變化

動物按體質量隨機分組后，各組間無差異（P＞0.05）。試驗期間空白對照組和模型對照組體質量穩定增長。SD大鼠經EDTA治療1周后，EDTA組各周體質量較空白對照組和模型對照組均顯著下降（P＜0.05）（圖1）。但小鼠經EDTA處理后， 各組間體質量差異無統計意義（P＞0.05）（圖2）。

2.2大鼠血鎘濃度、腎鎘和睪丸含量

造模結束后，模型組大鼠的腎臟和睪丸Cd含量及血Cd濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。EDTA治療3周后，EDTA治療組大鼠的血Cd濃度、腎Cd含量較模型對照組升高（P＜0.05）（表1）。

2.3小鼠血鎘濃度、腎鎘和睪丸含量

造模結束后，模型組小鼠的腎臟和睪丸Cd含量及血Cd濃度較空白對照組上升（P＜0.05）。EDTA治療4周后，治療組小鼠的血Cd濃度和腎Cd含量顯著高于模型對照組（P＜0.05）（表2）。

2.4大、小鼠24 h尿鎘含量

EDTA治療慢性鎘中毒大鼠3周后，模型對照和EDTA治療組大鼠24 h尿Cd總量均高于空白對照組（P＜0.05）； EDTA組24 h尿Cd總量較模型對照組升高（P＜0.05）。EDTA治療慢性鎘中毒小鼠4周后，模型對照和EDTA治療組小鼠24 h尿鎘總量均高于空白對照組（P＜0.05）； EDTA組24 h尿鎘總量較模型對照組升高（P＜0.05）（表3）。

表1　EDTA治療慢性鎘中毒大鼠的血鎘腎鎘和睪丸鎘變化

表2　EDTA治療慢性鎘中毒小鼠的血鎘腎鎘和睪丸鎘變化

表3　EDTA治療慢性鎘中毒大、小鼠的尿鎘變化

2.5大、小鼠腎臟和睪丸組織病理學觀察

EDTA治療SD大鼠3周后，模型對照組33% （2/6）的動物腎臟組出現腎小管內蛋白沉積； 模型對照組和EDTA組個別動物出現睪丸彌漫性曲細精管萎縮（圖3）。EDTA治療NIH小鼠4周后， EDTA組30% （3/10）的動物出現腎臟病理改變， 包括腎小管擴張、腎小管擴張伴管型和腎小管上皮細胞肥大（圖4）。

3　討論

現有研究表明，鎘進入體內后，首先蓄積于肝臟，并誘導肝細胞合成金屬硫蛋白，并與之結合生成Cd金屬硫蛋白復合物（Cd-MT），再經血液循環運送到腎臟，經腎小球濾過后被腎小管細胞重吸收。進入腎小管細胞內的鎘不能被排出，隨著時間的延長腎鎘含量不斷升高，導致細胞功能和器質性改變［4，14］。因此，腎臟為慢性鎘中毒的靶器官，治療慢性鎘中毒的關鍵是驅除腎臟細胞內的鎘。

本研究采用EDTA腹腔注射治療慢性鎘中毒大鼠模型3周和慢性鎘中毒小鼠模型4周后，結果顯示； EDTA組實驗動物腎臟Cd含量顯著高于模型對照； 隨著治療時間的延長腎臟鎘蓄積增加，從而導致大量的腎臟實質性病理改變。說明EDTA不能用于驅鎘治療，這與以往文獻報道相一致［7，15］。另外， EDTA組的動物尿Cd含量高于模型對照，也高于治療前水平，說明EDTA增加鎘從尿中排出，這正是目前認為可以用EDTA來驅鎘的原因。但從用藥后的動物體質量看，EDTA有較強的毒副作用，高劑量治療一周后體質量即顯著下降，因此在慢性鎘中毒時，不應采用EDTA治療。

國內外關于EDTA治療鎘中毒的研究均有報道，小劑量的EDTA對慢性鎘中毒患者驅鎘療效確切，但對腎臟重吸收功能有一定的影響； EDTA用于臨床鎘中毒治療時亦能促使患者尿鎘升高，但隨后患者腎功能下降，但其機制尚不清楚［7，16］。本課題組認為EDTA驅鎘及其毒副作用的機制可能為，因其為大分子絡合物，不能進入腎臟及肝臟細胞與胞內Cd2+結合將其帶出，但可以螯合血液中的部分Cd并從尿液排出，同時會不斷促使血液中部分Cd向肝臟和腎臟轉移，從而致使肝臟和腎臟內鎘含量上升加重機體損害。另外，睪丸組織是鎘暴露的特異敏感性靶器官。鎘能引起睪丸變性，生精小管的損害，從而影響大鼠生殖能力［17］。本研究結果表明模型組和EDTA組有的動物睪丸曲精小管萎縮，說明EDTA對鎘的睪丸毒性也無保護作用。綜上所述，EDTA用于驅鎘時，會促使血液中的Cd2+向肝臟、腎臟等臟器轉移對機體無保護作用，加之本身具有一定的毒副作用，在慢性鎘中毒時，不應采用EDTA治療。

圖3　EDTA對慢性鎘中毒大鼠腎臟和睪丸病理改變（HE ×200）

圖4　EDTA對慢性鎘中毒小鼠腎臟病理改變（HE ×200）

［1］環境保護部， 國土資源部. 全國土壤污染狀況調查公報［R］. 2014-04-17.

［2］喬實. 鎘毒猛于虎-我國鎘污染損害人體健康初探 ［M］. 北京: 華夏出版社， 2013.

［3］Nawrot TS， Staessen JA， Roels HA. Cadmium exposure in the population: from health risks to strategies of prevention［J］. Biometals， 2010， 23（5）:769-782.

［4］Sabath E， Robles-Osorio ML Renal health and the environment: heavy metal nephrotoxicity［J］. Nefrologia， 2012， 32（3）:279-286.

［5］王任群， 趙肅， 邱玉鵬， 等. 鎘污染區居民腎功能損害的研究［J］. 環境與健康雜志， 2006， 5（ 23）:202-204.

［6］李光先， 余日安. 鎘毒性作用干預方法及其機制研究進展［J］. 中國職業醫學， 2014， 41（2）:222-226.

［7］陳志強， 梁啟榮. 依地酸二鈉鈣的驅鎘效果及對腎臟功能的影響［J］. 醫學文選， 2005， 4（3）:339-340.

［8］孫貴范. 職業衛生與職業醫學［M］. 北京: 人民衛生出版社，2012.

［9］Flora SJ， Mittal M， Mehta A. Heavy metal induced oxidative stress & it’s possible reversal by chelation therapy ［J］. Indian J Med Res， 2008， 128（4）:501-523.

［10］ 蔡婷峰， 董明， 高洪彬， 等. 鎘致大鼠慢性腎損傷模型的探討［J］. 中國職業醫學， 2010， 37（3）:194-198.

［11］ 李穎超， 武昕， 嚴家榮， 等. 亞慢性鎘中毒腎功能性損傷小鼠模型的研究［J］. 山西醫科大學學報， 2013， 44（4）:267-270.

［12］ 中華人民共和國衛生行業標準. WS/T34-1996. 血中鎘的石墨爐原子吸收光譜測定方法［S］.

［13］ 中華人民共和國衛生行業標準. WS/T32-1996. 尿中鎘的石墨爐原子吸收光譜測定方法［S］.

［14］ Nordberg GF. Historical perspectives on cadmium toxicology ［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 2009， 238（3）:192-200.

［15］ Crinnion WJ. EDTA redistribution of lead and cadmium into the soft tissues in a human with a high lead burden-should DMSA always be used to follow EDTA in such cases［J］. Altern Med Rev， 2011， 16（2）:109-112.

［16］ Gil HW， Kang EJ， Lee KH， et al. Effect of glutathione on the cadmium chelation of EDTA in a patient with cadmium intoxication［J］. Hum Exp Toxicol， 2011， 30（1）:79-83.

Nephrotoxicity of EDTA Utilized to Treat Chronic Cadmium Poisoning in Rats and Mice

LI Guang-xian1，2， ZHONG Zhi-yong2， CHEN Jia-xing1，2， YU Ri-an1，TANG Xiao-jiang2
（1. School of Public Health， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510310， China；2. Guangdong Medical Laboratory Animal Center， Nanhai 528248， China）

ObjectiveTo investigate the side effects of （EDTA） utilized to treat chronic Cadmium poisoning in animals. MethodsMale SD rats and NIH mice were randomly divided to the control group and model group respectively. The model group animals were daily given CdCl2+ 2-Mercaptoethanol （ME， ip） for 5 days. 50 days or 30 days later， the rats or mice were randomly divided into model control group and EDTA treatment group respectively. The control group and model control group were injected with saline， and the EDTA group animals were treated with EDTA solution .At the end of the experiment，theurine， blood， kidneys and testis were collected for detecting the Cd concentration and pathologic changes. ResultsCompared with the model control group， in the EDTA treated groups （both in rats and mice）， the Cd levels of kidney， urine and blood all increased significantly （P＜0.05）； protein precipitation could be detected in kidney tubules. ConclusionThe EDTA could promote the accumulation of cadmium in the kidney. EDTAis not recommended to treatchronic cadmium poisoning patients.

Chronic cadmium poisoning； EDTA； Nephrotoxicity

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0056-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.012

2014-07-17

廣東省重大科技專項（2012A080201011），佛山市院市合作項目（2012A04）

李光先（1987-）， 女， 碩士研究生， 主要研究方向: 環境與職業毒理學， E-mail: lig_xian@163.com

唐小江， 博士、主任醫師，E-mail: river-t@126.com