改良小鼠腎移植模型的建立

黃健兵, 丁芳寶, 劉　浩, 梅　舉

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科, 上海　200092）

改良小鼠腎移植模型的建立

黃健兵, 丁芳寶, 劉浩, 梅舉

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科, 上海200092）

目的改進(jìn)小鼠腹腔腎臟移植的手術(shù)方法，提高手術(shù)成功率。方法選用25對(duì)C57BL/6小鼠行同種同品系腎臟移植手術(shù)，8只C57BL/6小鼠切除腎臟作對(duì)照。簡(jiǎn)化供體腎獲取方法，從供體腎背側(cè)開(kāi)始分離，并減少腎動(dòng)靜脈游離范圍，腎動(dòng)脈開(kāi)口以血管片方式獲取。改進(jìn)動(dòng)靜脈吻合技術(shù)，將供體腎動(dòng)、靜脈分別與受體腹主動(dòng)脈、下腔靜脈行端側(cè)吻合。尿道重建將供體腎輸尿管末端引入膀胱內(nèi)，固定輸尿管壁于膀胱外膜。分兩期切除受體自身腎臟。結(jié)果手術(shù)成功率為92%，總手術(shù)時(shí)間為47.6±8.7 min，熱缺血時(shí)間3～5 s，冷缺血時(shí)間31.1±6.3 min。結(jié)論小鼠腹腔異位腎臟移植手術(shù)方法的改進(jìn)能提高手術(shù)成功率，易于學(xué)習(xí)掌握，值得推廣應(yīng)用。

小鼠； 腎； 移植； 動(dòng)物模型

自1973年Skoskiewicz等［1］首次開(kāi)展小鼠腎臟移植手術(shù)以來(lái)，全球有多家較大的移植中心進(jìn)行了此手術(shù)，最初主要用于不同基因小鼠腎臟移植后免疫排斥的研究，但由于該手術(shù)難度較大，早期手術(shù)成功率不高（僅33%～50%）［2］，且使用小鼠皮膚及心臟移植已可很好地進(jìn)行免疫排斥研究，小鼠腎移植在1980年代后未能廣泛開(kāi)展。但隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官移植模型將成為從分子水平研究移植免疫的新手段。而相對(duì)于大鼠及其它大動(dòng)物而言，小鼠有其不可替代的優(yōu)點(diǎn)： 人們對(duì)小鼠基因組特征的認(rèn)識(shí)比大鼠及其它任何大動(dòng)物都清楚，轉(zhuǎn)基因小鼠種系較純, 已有大量的純種小鼠及單抗可用，而有些蛋白成分如酶或趨化因子只能通過(guò)特定細(xì)菌或細(xì)胞分泌產(chǎn)生，產(chǎn)量非常少，無(wú)法批量用于大動(dòng)物甚至大鼠。另外，小鼠腎臟移植與其他器官移植相比，其移植物在主要組織相容性抗原有一定差異的情況下, 仍可能長(zhǎng)期存活, 更適于研究排斥反應(yīng)長(zhǎng)期發(fā)展過(guò)程中的免疫調(diào)控機(jī)制。因此小鼠腎移植模型再次成為研究的熱點(diǎn)。 作者在借鑒國(guó)內(nèi)外報(bào)道的手術(shù)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷的摸索及大量的練習(xí)，改進(jìn)了小鼠腎移植模型，使其更加簡(jiǎn)便易行，成功率較高。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雌性C57BL/6 （H2b） 小鼠58 只, 體質(zhì)量16～22 g, 購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［SYXK（滬） 2013-0050］, 并飼養(yǎng)（飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料）在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［SYXK（滬）2013-0106］, 6～8 周齡時(shí)手術(shù)。50只小鼠隨機(jī)分25對(duì)作腎臟移植，8只小鼠作對(duì)照。

1.2手術(shù)器械及試劑

手術(shù)顯微鏡（上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）； 血管夾（Accurate Surgical & Scientific Instruments 公司） ；顯微持針器（Eriem Surgical 公司）； 顯微剪刀和鑷子（Fine Science Tools 公司）； 11/0 帶針縫線和6/0 醫(yī)用絲線（上海金環(huán)醫(yī)用縫線廠） ； 戊巴比妥鈉（Sigma公司，P3761）、異氟烷（河北九派制藥股份有限公司，H19980141）和肝素鈉（上海醫(yī)藥集團(tuán)公司）。手術(shù)操作均在10～25倍顯微鏡下完成。

1.3手術(shù)方法

1.3.1供體手術(shù)采用腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 65% 戊巴比妥鈉（0.01 mL/g） 麻醉。剃除腹部被毛，小鼠取仰臥位，術(shù)野消毒。取腹正中切口，自制拉鉤

1.3.2受體手術(shù)與供體手術(shù)相同方法麻醉小鼠后剃毛，取仰臥位固定，尾端朝向術(shù)者。術(shù)野消毒，腹部正中切口自制拉鉤牽引固定； 將小腸向左上方推移至腹腔外，并以濕潤(rùn)的小紗布覆蓋保護(hù)；游離顯露出約5 mm長(zhǎng)的一段腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，以血管夾將動(dòng)靜脈一并鉗夾固定（圖2）。縱行剪開(kāi)腹主動(dòng)脈和下腔靜脈。首先行動(dòng)脈端側(cè)吻合，供腎置于左側(cè)，動(dòng)、靜脈吻合順序見(jiàn)圖3； 吻合完成后，開(kāi)放血管夾，可見(jiàn)腎臟血供恢復(fù)，呈紅色。輸尿管重建方法： 用顯微血管鑷從膀胱前下方無(wú)血管區(qū)刺入，自后上方無(wú)血管區(qū)刺出，夾住供體輸尿管末端，將輸尿管拉入膀胱并從下方拉出約3 mm，用顯微血管夾夾住供體輸尿管末端，在供體輸尿管穿入膀胱的地方利用供體輸尿管的脂肪等結(jié)締組織與膀胱壁間斷縫合3針固定，剪去被夾輸尿管末端，使其新末端自然收縮入膀胱內(nèi), 最后荷包縫合該處膀胱開(kāi)口。輕提輸尿管，確認(rèn)固定良好，膀胱充盈后輸尿管口周圍無(wú)滲漏。

游離受體左腎腎蒂組織，套8-0絲線結(jié)扎，于結(jié)扎線遠(yuǎn)心端切除受體左腎，保留少量腎組織可防止結(jié)扎線滑脫。腸管復(fù)位，全層連續(xù)縫合關(guān)閉腹部切口。移植后3 d以異氟烷 吸入麻醉后，經(jīng)右肋下切口顯露右腎，套8-0絲線結(jié)扎腎蒂后切除右腎。全層連續(xù)縫合關(guān)閉肋下切口。

1.3.3對(duì)照組手術(shù)與供體手術(shù)相同方法麻醉小鼠后剃毛，取仰臥位固定，術(shù)野消毒，腹部正中切口自制拉鉤牽引固定，游離左腎腎蒂，套8-0絲線結(jié)扎，于結(jié)扎線遠(yuǎn)心端切除左腎。全層連續(xù)縫合關(guān)閉腹部切口。3 d后以異氟烷 吸入麻醉，經(jīng)右肋下切口切除右腎。

1.4術(shù)后處理

術(shù)后將小鼠置于37 ℃暖箱內(nèi)復(fù)溫, 自由活動(dòng)后放回籠內(nèi), 正常進(jìn)食水。每日觀察小鼠活動(dòng)情況。

圖1　取腎動(dòng)脈開(kāi)口血管片示意圖

圖2　血管夾示意圖

A： 動(dòng)脈吻合順序，腎臟放于左側(cè)，先將供體動(dòng)脈口血管片上端與受體動(dòng)脈切口上端a點(diǎn)間斷縫一針，再將供體血管片下端與切口下端b點(diǎn)縫合一針，以b點(diǎn)處縫線沿右側(cè)向上連續(xù)縫合，至上端后將供體腎翻轉(zhuǎn)至右側(cè)，繼續(xù)連續(xù)縫合左側(cè)緣至下端b點(diǎn)處與線頭打結(jié)，完成動(dòng)脈吻合。B： 靜脈吻合順序，供體靜脈口下端與受體靜脈切口下端c點(diǎn)間斷縫合一針固定，上端d點(diǎn)縫合一針后以此針為連續(xù)縫合線，先于右側(cè)緣進(jìn)針后于血管內(nèi)向下連續(xù)縫合右側(cè)緣，至下端后穿至血管外，再沿左側(cè)緣向上連續(xù)縫合，至d點(diǎn)與線頭打結(jié)完成靜脈吻合

2　結(jié)果

供體手術(shù)時(shí)間為8.8±2.5 min , 熱缺血時(shí)間約3～5 s, 冷缺血時(shí)間31.1±6.3 min, 動(dòng)、靜脈吻合時(shí)間24.7±5.6 min, 輸尿管吻合時(shí)間4.5±1.0 min，總手術(shù)時(shí)間為47.6±8.7 min。對(duì)照組所有小鼠均在二期腎切除后3 d內(nèi)死亡。考慮到移植腎在術(shù)后一周內(nèi)有慢性血栓形成的可能，移植組均以二期腎切除后觀察10 d為限, 能正常存活且活動(dòng)良好視為手術(shù)成功，移植組的手術(shù)成功率為92%（表1）。共死亡2例, 其1例在術(shù)后即刻出現(xiàn)腎動(dòng)脈吻合口血栓, 1例術(shù)后1周內(nèi)死亡，探查提示腎動(dòng)脈血栓。

3　討論

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，小鼠的腎臟移植模型日趨受到重視，但因其技術(shù)要求較高，尚未廣泛開(kāi)展。目前開(kāi)展小鼠腎移植的中心遠(yuǎn)較其他移植手術(shù)少，成功率多在50%～90%［1,3-8］, 總手術(shù)時(shí)間可控制在70～80 min［4］, 本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)手術(shù)方法后, 成功率達(dá)到了92%, 總手術(shù)時(shí)間減少至47.6±8.7 min,體現(xiàn)了一定的優(yōu)勢(shì)。

表 1　腎移植組及對(duì)照組小鼠存活時(shí)間

本手術(shù)技術(shù)在參考前人經(jīng)驗(yàn)［9］的基礎(chǔ)上作了新的改進(jìn)，并通過(guò)大量練習(xí)后獲得了良好的效果。在供體手術(shù)時(shí)，先游離切斷輸尿管，輕提輸尿管，可非常方便的分離腎后組織至腎動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈，背側(cè)分支血管顯露良好，易電凝處理；腎靜脈表面處理范圍小，除腎上腺下靜脈外，需要處理的分支血管少； 僅阻斷一側(cè)腹主動(dòng)脈，且使用微血管夾代替線結(jié)扎阻斷，操作方便，分離組織少，可明顯節(jié)約時(shí)間，同時(shí)也可保證能阻斷腎動(dòng)脈血供，保證灌注良好。供體動(dòng)脈開(kāi)口使用血管片的方式留取，與文獻(xiàn)報(bào)道［8,9］的留取一段腹主動(dòng)脈的方法相比，腹主動(dòng)脈游離范圍小，處理方便，獲取簡(jiǎn)單，且可保證足夠大的吻合口。

受體手術(shù)時(shí)，進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的改進(jìn)： 使用血管夾阻斷腹腔動(dòng)、靜脈，不需要分離結(jié)扎受體動(dòng)靜脈的分支, 既節(jié)省時(shí)間，又不影響術(shù)后側(cè)支血管的血供。動(dòng)脈受體切口不小于供體動(dòng)脈血管片長(zhǎng)徑，供體動(dòng)脈開(kāi)口血管片總長(zhǎng)徑為腎動(dòng)脈開(kāi)口徑三倍左右； 受體靜脈切口長(zhǎng)徑略大于供體靜脈開(kāi)口直徑，吻合口均使用一端定點(diǎn)縫針后, 從另一端起連續(xù)縫合的方法, 控制好針距，動(dòng)脈兩側(cè)各3～4針，靜脈兩側(cè)各4～5針，并在結(jié)尾處打結(jié)，既不增加血栓的發(fā)生率，又可極大的減少出血的可能。吻合血管的關(guān)鍵要看清血管內(nèi)膜，進(jìn)針邊距合適，如未縫到內(nèi)膜將導(dǎo)致術(shù)后血栓形成，而邊距過(guò)大將引起吻合口狹窄； 縫線、打結(jié)時(shí)注意不要拉太緊，否則易導(dǎo)致吻合口狹窄。

小鼠腎移植時(shí)輸尿管的移植，因輸尿管太細(xì)而無(wú)法進(jìn)行端端吻合，如果取供體時(shí)留部分輸尿管開(kāi)口膀胱瓣［10,11］則操作復(fù)雜，增加供體獲取時(shí)間，且易引起吻合后膀胱瓣的缺血壞死。本實(shí)驗(yàn)將輸尿管直接拉入膀胱，僅在入口處縫合固定輸尿管而使其末端游離于膀胱內(nèi)，操作簡(jiǎn)便，效果良好。

總之，小鼠腹部腎臟移植模型的建立需要熟練的顯微外科技巧和合適的手術(shù)方法，作者對(duì)手術(shù)方法關(guān)鍵之處的改進(jìn)能提高手術(shù)成功率，增加模型的穩(wěn)定性，易于學(xué)習(xí)掌握，值得推廣應(yīng)用。

［1］Skoskiewicz M, chase C, Winn HJ, et a1. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity［J］. Transplant Proc, 1973, 5（1）：721-725.

［2］Russell PS, Chase CM, Colvin RB, et al. Kidney transplants in mice.An analysis of the immune status of mice bearing long-term H2 incompatible transplants［J］. J Exp Med, 1978, 147（5）：1449-1468.

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［10］ 趙大強(qiáng), 汪璐蕓, 華學(xué)鋒, 等. 小鼠腎移植模型中膀胱-膀胱吻合尿路重建術(shù)的改進(jìn)［J］. 器官移植, 2013, 4（6）：362-366.

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Improvement on Kidney Transplantation Model in Mice

HUANGJian-bing, DING Fang-bao, LIU Hao, MEI Ju
（Department of Cardiothoracic Surgery， Xinhua Hospital， Shanghai Jiao
Tong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

ObjectiveTo improve the technique of kidney transplantation model in mice and to increase the success rate of operation. MethodsTotally 25 pairs of C57BL/6 mice were used for kidney transplantations, and 8 C57BL/6 mice were used for control after nephrectomy. To simplify the donor kidney acquisition method, begin to separate the donor kidney from the dorsal side, reduce the separation range of the renal arteriovenous. Obtain the artery at a vascular patch. Improve the arteriovenous anastomosis technique. The donor renal artery and vein is sutured to the recipient abdominal aorta and inferior vena cava respectively by end to side anastomosis. The urethral ends of the donor were put into the recipient bladder to reconstruct the ureter, and fix the ureteral wall to the outer membrane of the bladder. The natural kidneys of the recipients were excised by two phases. ResultsThe success rate of operation was 92%, the total operation time was 47.6±8.7 min, warm ischemia time was 3～5 s, cold ischemia time was 31.1±6.3 min. ConclusionThe improvement technique of kidney transplantation model in mice can improve the success rate of operation. It is easy to learn and is worth to be widely applied.

Mice； Kidney； Transplantation； Model

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0374-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.006牽引顯露腹腔臟器，將腸道組織置于術(shù)野左側(cè)顯露小鼠左腎。用顯微血管鑷小心游離左側(cè)輸尿管及部分輸尿管周圍脂肪, 上至左腎下極, 下至其入膀胱處,并于膀胱入口處切斷輸尿管，避免損傷輸尿管。剪開(kāi)腎周脂肪囊，輕提輸尿管，沿腎背面由下往上游離左腎背側(cè)，直至腹主動(dòng)脈，沿腎動(dòng)脈水平上下游離腹主動(dòng)脈各約0.5 cm，電凝切斷可見(jiàn)分支血管。放回腎臟，游離左腎靜脈開(kāi)口附近腹腔靜脈，范圍往上下各約0.5 cm，并游離部分開(kāi)口處腎靜脈。電凝、剪斷左腎上腺下靜脈。游離完畢，用顯微血管夾在腎靜脈水平上約0.5 cm夾閉近心端腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈水平下端約0.8 cm 處用30 G 針頭斜行向心穿刺腹主動(dòng)脈, 緩慢灌注4 ℃肝素生理鹽水（10 U/mL） 1 mL, 可見(jiàn)腎臟呈蒼白色。沿腎靜脈匯入下腔靜脈處剪開(kāi)腎靜脈前壁、后壁，鈍性推開(kāi)腎靜脈及其周圍組織，顯露下方腎動(dòng)脈開(kāi)口，顯微血管剪刀于腎動(dòng)脈開(kāi)口下方起弧行向上剪下腎動(dòng)脈開(kāi)口周圍部分腹主動(dòng)脈血管壁（圖1）。將腎放入4 ℃肝素生理鹽水（10 U/mL）中備用。

2015-03-17

上海市科委基金（13XD1403200）

黃健兵（1979-）, 男, 醫(yī)學(xué)博士, 主治醫(yī)師。E-mail： jb4480@163.com