改良大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)模型的建立及病理形態(tài)初步觀察

洪景芳，徐維華，王守森

（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)外科，福州 350025）

改良大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)模型的建立及病理形態(tài)初步觀察

洪景芳，徐維華，王守森

（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)外科，福州 350025）

目的使用改良方法建立一種穩(wěn)定可靠的大鼠內(nèi)膜剝脫術(shù)（CEA）模型，觀察術(shù)后組織形態(tài)學(xué)變化及平滑肌細(xì)胞增殖情況。方法將48只SD大鼠分為改良組和常規(guī)組，每組24只；通過(guò)切開前穿刺血管前壁和預(yù)先留置縫線建立改良CEA模型，比較兩組建模成功率及建模手術(shù)時(shí)間，HE染色觀察術(shù)后3 d、14 d和28 d血管壁厚度動(dòng)態(tài)變化，免疫組織化學(xué)方法測(cè)量不同時(shí)期血管壁增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)情況。 結(jié)果成功構(gòu)建改良大鼠CEA模型。改良組建模成功率（87.5%）與常規(guī)組（79.2%）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.46），改良組手術(shù)時(shí)間（31.2±3.7 min）顯著低于常規(guī)組（40.9±4.2 min）（P=0.00）；改良組術(shù)后28 d管壁厚度（258.4±20.9 μm）較術(shù)后3 d（116.3± 14.6 μm）顯著增厚（P＜0.01）；改良組術(shù)后28 d管腔內(nèi)徑（309.6±32.8 μm）較術(shù)后3 d （602.8±40.5 μm）顯著狹窄（P＜0.01）；PCNA表達(dá)在3 d為稍高表達(dá)，14 d為高表達(dá)，至28 d未見表達(dá)。結(jié)論改良的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除模型成模率高，操作簡(jiǎn)單，建模手術(shù)時(shí)間短，穩(wěn)定可靠，適用于CEA術(shù)后再狹窄的研究。

頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)（CEA）；動(dòng)物模型；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）

在缺血性腦血管疾病中，15%～20%是由頸動(dòng)脈粥樣斑塊形成引起的血管狹窄或閉塞所致。頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)（carotid endarterectomy，CEA）是目前預(yù)防缺血性腦卒中的常見手術(shù)方式［1］。CEA術(shù)后再狹窄發(fā)生率為1.1%～6.9%［2］，有學(xué)者甚至認(rèn)為，CEA術(shù)后動(dòng)脈再狹窄發(fā)生率可高達(dá)37%［3，4］。穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是研究CEA術(shù)后內(nèi)膜增生的重要手段，作者在原有大鼠CEA模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，取得了滿意效果，現(xiàn)將改良大鼠CEA模型的建立及增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在CEA術(shù)后血管壁的表達(dá)情況報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［SCXK（滬）2012-0002］，在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［SYXK（閩）2013-0004］。分為改良模型組和常規(guī)模型組，每組24只。

1.2主要試劑和儀器

顯微持針器及顯微鑷，上海金鐘醫(yī)療器械有限公司；手術(shù)顯微鏡，江蘇鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；術(shù)中多普勒超聲血流探測(cè)儀，美國(guó)VTI公司；不銹鋼雙面剃須刀片，上海吉列有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科制劑室產(chǎn)品；兔抗大鼠PCNA單克隆抗體，英國(guó)Abcam公司；DAB顯色試劑盒，福州邁新生物科技有限公司。

1.3建立改良CEA模型及常規(guī)CEA模型

SD大鼠術(shù)前常規(guī)禁食8 h，禁飲4 h，10%水合氯醛0.3～0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，消毒頸部皮膚，鋪無(wú)菌洞巾（圖1）。用剪刀沿頸部正中處縱形剪開頸前皮膚，上至下頜，下至胸骨上緣，切口長(zhǎng)約3～3.5 cm，銳性分離皮下筋膜，推開下頜下腺。以下在顯微鏡下操作，沿左側(cè)胸鎖乳突肌及頸前肌群間隙分離，將胸鎖乳突肌向外側(cè)牽拉，暴露左側(cè)頸動(dòng)脈鞘。鈍性游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)約13 mm。予100 U/kg肝素大鼠尾部靜脈注射行肝素化后，用無(wú)損血管夾依次夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端及近心端（間隔10 mm）（以上步驟兩組無(wú)差別，以下步驟分為改良模型組及常規(guī)模型組，詳見表1所示）。術(shù)后均予青霉素20萬(wàn)單位肌肉注射，連用3 d。普通飼料喂養(yǎng)。

1.4計(jì)算建模手術(shù)時(shí)間及建模成功率

分別計(jì)算兩組從開始夾閉頸動(dòng)脈遠(yuǎn)、近心端到打完最后一個(gè)結(jié)松開血管夾的操作時(shí)間，定義為建模手術(shù)時(shí)間。術(shù)后即刻手術(shù)血管通暢，14 d見內(nèi)膜增生，28 d后大鼠成活且管腔未完全閉塞者（多普勒超聲血流探測(cè)儀探頭測(cè)定有血流信號(hào)）定義為建模成功。

表 1　改良模型組與常規(guī)模型組具體操作步驟的區(qū)別

1.5動(dòng)脈壁及管腔內(nèi)腔的測(cè)定

術(shù)后3 d、14 d及28 d，每組各8只大鼠（死亡者除外）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)原切口進(jìn)入并找到左側(cè)頸動(dòng)脈，分別結(jié)扎手術(shù)段血管近端和遠(yuǎn)端，取下后用肝素生理鹽水沖洗，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋后常規(guī)切片備HE染色或免疫組織化學(xué)用。每個(gè)標(biāo)本取非連續(xù)的4個(gè)層面切片，HE染色后采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量動(dòng)脈壁厚度及血管內(nèi)腔。隨機(jī)取材改良組或常規(guī)組右側(cè)頸動(dòng)脈作為正常血管對(duì)照。

1.6免疫組織化學(xué)法測(cè)定PCNA在血管壁中的表達(dá)

取材標(biāo)本及時(shí)間點(diǎn)同上。免疫組織化學(xué)染色采用ABC法，具體操作步驟參照ABC免疫組織化學(xué)法試劑盒說(shuō)明書。所用一抗為兔抗PCNA單抗，二抗為羊抗兔IgG。在每張切片上取4個(gè)區(qū)域，在顯微鏡（200×）下拍照，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件測(cè)量每條動(dòng)脈12個(gè)200倍視野下增殖細(xì)胞在平滑肌層占總細(xì)胞數(shù)百分比。計(jì)算其均值，將數(shù)值納入統(tǒng)計(jì)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x-± s或率（%）表示。組間建模成功率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1建模情況

改良組雄性SD大鼠共24只，其中1只死于麻醉意外，1只術(shù)中多普勒超聲探測(cè)儀未探及血流信號(hào)，提示頸動(dòng)脈縫合后血管不通暢，考慮急性血栓形成，1只在術(shù)后次日死亡于術(shù)區(qū)血腫壓迫氣管，成功建模21只，建模成功率87.5%，死亡率4.2%；常規(guī)組雄性SD大鼠共24只，1只在內(nèi)膜剝除后準(zhǔn)備打結(jié)縫線時(shí)大鼠麻醉提前清醒后躁動(dòng)，導(dǎo)致血管撕裂，1只術(shù)后即刻急性血栓形成，1只術(shù)后3 d死于局部血腫壓迫，術(shù)后14 d及28 d取材發(fā)現(xiàn)各有1只術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈閉塞，成功建模19只，建模成功率79.2%，死亡率4.2%。兩組比較，雖然改良組建模成功率高于常規(guī)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.46）。

2.2建模手術(shù)時(shí)間比較

改良組平均手術(shù)時(shí)間為31.2±3.7 min，常規(guī)組平均手術(shù)時(shí)間為40.9±4.2 min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。

2.3頸動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察

頸動(dòng)脈切片行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察（圖2），正常大鼠頸動(dòng)脈由內(nèi)膜、中膜和外膜層構(gòu)成，其中內(nèi)膜為單層連續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞。中膜由3～5層平滑肌細(xì)胞環(huán)形排列構(gòu)成，呈波浪狀。CEA術(shù)后3 d，可見內(nèi)膜層缺如，動(dòng)脈壁吻合處平滑肌層斷裂，局部見縫合線殘留，管腔內(nèi)壁不光滑。術(shù)后14 d，可見新生內(nèi)膜形成，內(nèi)膜層增厚并有較多有核細(xì)胞。術(shù)后28 d，頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜明顯增厚，動(dòng)脈內(nèi)腔明顯狹窄。動(dòng)脈壁厚度28 d時(shí)最大，為258.4 ±20.9 μm，與術(shù)后3 d、14 d時(shí)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；管腔內(nèi)徑術(shù)后第28 d時(shí)最小，為309.6±32.8 μm，與術(shù)后3 d、14 d時(shí)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；改良組和常規(guī)組之間形態(tài)學(xué)觀察以及術(shù)后3 d、14 d、28 d時(shí)管壁厚度及管腔內(nèi)徑比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），詳見表2。

圖 1　大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)

表 2　不同時(shí)間點(diǎn)改良及常規(guī)大鼠CEA模型管壁厚度和管腔內(nèi)徑的變化　　　　　μm

圖 2　大鼠正常頸動(dòng)脈和內(nèi)膜切除術(shù)后不同時(shí)期HE染色（×200）

圖 3　PCNA免疫組織化學(xué)染色顯示增殖細(xì)胞在大鼠正常頸動(dòng)脈及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)分布（×200）

2.4內(nèi)膜切除頸動(dòng)脈細(xì)胞增殖情況

PCNA免疫組織化學(xué)染色在血管平滑肌層可見增殖細(xì)胞散在表達(dá)，細(xì)胞核被染成棕褐色，提示抗原存在細(xì)胞核內(nèi)。增殖細(xì)胞在3 d出現(xiàn)，14 d達(dá)高峰，以后進(jìn)行性下降，至28 d增殖細(xì)胞未見表達(dá)（圖3）。改良組和常規(guī)組之間術(shù)后3 d、14 d、28 d時(shí)PCNA表達(dá)情況比較無(wú)明顯差異。

3　討論

穩(wěn)定可靠并與臨床上CEA手術(shù)相符的動(dòng)物模型是研究動(dòng)脈術(shù)后再狹窄的重要工具。大鼠CEA術(shù)后再狹窄模型的建立方法主要有頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫損傷法、球囊損傷法和氣體內(nèi)膜干燥損傷法，其中球囊損傷法和氣體內(nèi)膜干燥損傷法雖然模型制作相對(duì)簡(jiǎn)單，但與臨床上CEA手術(shù)對(duì)動(dòng)脈造成的損傷方式不相符［5，6］，而內(nèi)膜剝脫損傷法與CEA相似，在國(guó)外已經(jīng)被廣泛使用［7-9］。傳統(tǒng)的造模方法為，暴露左側(cè)頸動(dòng)脈后，在顯微鏡下用顯微剪縱形剪開動(dòng)脈約6 mm，并在內(nèi)膜表面劃垂直切口的平行線（間距4 mm），用顯微鑷仔細(xì)剝除內(nèi)膜層，然后再用11-0縫線縫合動(dòng)脈［10］。該方法存在2個(gè)主要缺陷：①大鼠頸動(dòng)脈直徑細(xì)小，顯微剪刀在剪開血管前壁及剝離內(nèi)膜時(shí)由于血管缺乏固定較為困難，容易人為損傷血管；②由于大鼠頸動(dòng)脈壁本身較薄，當(dāng)內(nèi)膜層被剝除后，動(dòng)脈壁因失去內(nèi)皮層支撐而塌陷，此時(shí)再逐針貫穿縫合動(dòng)脈時(shí)對(duì)術(shù)者顯微鏡下縫合技術(shù)要求較高，針距線距難以保持均勻，易人為造成縫合后動(dòng)脈狹窄，尤其對(duì)于剛剛接觸顯微外科并且是科研主力的研究生來(lái)講往往很難嫻熟操作，作者在制作常規(guī)組模型時(shí)有兩例發(fā)生管腔閉塞，而改良組則沒(méi)有發(fā)生，考慮人為因素造成血管狹窄致閉塞可能，因此，按照常規(guī)方法制作模型制作難度大，且穩(wěn)定性相對(duì)較差。張宏偉等［11］利用金剛鉆頭磨除內(nèi)膜制作了新的CEA模型，但該模型本質(zhì)上并沒(méi)有改變頸動(dòng)脈缺乏固定及縫合困難的缺陷。

針對(duì)上述模型制作過(guò)程中的缺陷，本研究在原動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，首先在暴露并夾閉左側(cè)頸動(dòng)脈兩端后，先用針頭（30G×1/2''）縱形穿刺動(dòng)脈前壁，動(dòng)脈前壁兩穿刺點(diǎn)間距離約為6 mm，11-0縫線間斷掛線不打結(jié)，針距約0.6 mm，邊距約0.1 mm，切開頸總動(dòng)脈后，通過(guò)掛線之間的廣泛空間進(jìn)行剝離內(nèi)膜的操作，內(nèi)膜完全剝離后，將原先留置的11-0縫線相應(yīng)兩端依次打結(jié)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)：①通過(guò)細(xì)針頭穿刺血管前壁很好地固定了頸動(dòng)脈；②在切開前壁及剝除內(nèi)膜前預(yù)先間斷縫合掛線時(shí)針距、線距非常均勻合理，③改用消毒滅菌剃須刀片沿穿刺針切開不會(huì)損傷血管后壁，且切口平直損傷小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，改良后的方法能有效避免因縫合因素引起的動(dòng)脈狹窄，大大降低了手術(shù)操作難度，減少了手術(shù)時(shí)間。該方法穩(wěn)定性好，簡(jiǎn)單易重復(fù)。雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示兩組之間建模成功率無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但改良組中發(fā)生急性血栓形成管腔閉塞及早期閉塞的僅1例，而常規(guī)組中共有3例，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量相對(duì)較少有關(guān)。切片病理染色提示損傷后3 d， 內(nèi)膜層剝離完整，14 d時(shí)新生內(nèi)膜生成，新生內(nèi)膜含有較多增殖細(xì)胞，28 d時(shí)新生內(nèi)膜層進(jìn)一步增厚，管腔明顯狹窄，動(dòng)脈壁厚度術(shù)后3 d、14 d比較增厚有顯著差異（P＜0.01）。這些病理改變與Bledsoe等［12］報(bào)道的動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后內(nèi)膜增生、動(dòng)脈狹窄的病理改變相符，而且改良組和常規(guī)組比較形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異，證實(shí)成功建立改良大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫模型。

本研究在模型制作中的創(chuàng)新點(diǎn)是：在動(dòng)脈切開前預(yù)先縱行穿刺血管前壁及留置縫線，容易控制縫合的邊距和間距。當(dāng)內(nèi)膜剝除完整后，將事先留置的縫線相應(yīng)打結(jié)，有效避免了因縫合導(dǎo)致的動(dòng)脈狹窄，提高了手術(shù)時(shí)間，大大降低了手術(shù)難度，提高了造模成功率。其它的經(jīng)驗(yàn)包括：①水合氯醛麻醉效果穩(wěn)定，優(yōu)于氯胺酮、戊巴比妥鈉、乙醚等其它麻醉劑；②術(shù)中肝素化，切開動(dòng)脈壁后用肝素鹽水沖洗清潔管腔；③使用針頭在內(nèi)膜上劃平行線時(shí)要輕柔，盡量避免損傷動(dòng)脈中膜層。

本研究通過(guò)改良方法成功建立大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫模型，對(duì)術(shù)后不同時(shí)期血管內(nèi)膜增生情況進(jìn)行了連續(xù)、動(dòng)態(tài)觀察。血管中膜平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化是CEA術(shù)后新生內(nèi)膜的主要成分，PCNA可以評(píng)估新生內(nèi)膜的增殖狀態(tài)［13］。從PCNA在動(dòng)脈壁分布情況來(lái)看，術(shù)后3 d動(dòng)脈壁存在較多增殖細(xì)胞，術(shù)后14 d增殖細(xì)胞在動(dòng)脈壁中的含量達(dá)最高峰，術(shù)后28 d動(dòng)脈壁增殖細(xì)胞含量顯著減少，提示術(shù)后內(nèi)膜增生主要發(fā)生在28 d以內(nèi)，故防治術(shù)后再狹窄應(yīng)側(cè)重于早期。

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Establishment of Modified Rat Carotid Endarterectomy Model and Preliminary Observation on Changes of Pathological Morphology

HONG Jing-fang，XU Wei-hua，WANG Shou-sen
（Department of Neurosurgery，F(xiàn)uzhou General Hospital，Nanjing Command，F(xiàn)uzhou 350025，China）

ObjectiveTo establish a steady and reliable rat model of carotid endarterectomy （CEA）by improved method，and to explore the changes of pathological morphology of vascular wall and proliferation of vascular smooth muscle cells after CEA. MethodsForty-eight SD rats were divided into two groups with 24 rats in each group （modified CEA group and conventional CEA group）. The modified model was created by puncturing the carotid artery with a thin needle and detaining sutures before a longitudinal arteriotomy was performed；The success rate of modeling and the operation time were observed to evaluate the characteristics and reliability of two models. HE staining was performed to measure dynamic changes of the thickness of the vascular walls and immunohistochemistry was used to find expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） on vessel wall on 3 days，14 days and 28 days after operation. ResultThe model of rat carotid endarterectomy were successfully constructed. There was no significant difference in the success rate of modeling between two groups （87.5% vs 79.2%，P=0.46）. The operation time （31.2±3.7 min） of modified group was significantly lower than that （40.9± 4.2 min） of conventional group （P=0.00）. Twenty-eight days after the operation，the thickness of the artery and the luminal diameter were significantly different from those of 3 days after the operation in modified group. The positive expression of PCNA was slightly higher on 3 days after operation，the highest on 14 days，and there was no positive expression on 28 days. ConclusionModified rat carotid endarterectomy model has the characters of high success rate and simple handling，short operation time，and as a steady and reliable model，it is suitable for the study of restenosis after CEA.

Carotid endarterectomy（CEA）；Animal models；Proliferating Cell Nuclear Antigen（PCNA）

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0182-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.002

2014-12-01

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0036）

洪景芳（1976-），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向: 腦血管病的臨床和基礎(chǔ)研究，E-mail: yellowcard2001@163.com

王守森（1965-），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向: 腦血管病和腦腫瘤，E-mail: wshsen126@126.com