雷公藤涂膜劑的制備及其體外透皮試驗

周 密， 徐曉勇， 馬鳳森，*， 梁 宜

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江　杭州　310014；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江　杭州　310009）

雷公藤涂膜劑的制備及其體外透皮試驗

周 密1， 徐曉勇1， 馬鳳森1，2*， 梁 宜2

（1.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州310014；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310009）

目的 對雷公藤涂膜劑進行處方工藝篩選及體外透皮性能研究。方法 采用正交試驗篩選優(yōu)化處方，并對涂膜劑的制劑流動性，成膜時間，外觀質量進行評價；以去甲澤拉木醛為指標，采用Franz擴散池考察其透皮吸收行為。結果 雷公藤涂膜劑的最佳處方為1.5%雷公藤浸膏粉，5%聚乙烯醇（PVA）-124，4%丙二醇，30%無水乙醇。12 h透皮試驗平均累積透過率為73.09%，平均累積透過量為55.19μg/cm2。結論 所制備的雷公藤涂膜劑的成膜時間短且成膜質量好，滲透穩(wěn)定持久，釋放率高。

雷公藤；去甲澤拉木醛；涂膜劑；體外透皮

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.有祛風活絡、破淤止痛等功效，臨床常用于風濕性和類風濕性關節(jié)炎（RA）的治療［1］。其中二萜類、三萜類為其主要活性成分［2］。二萜類成分中的雷公藤甲素是雷公藤治療風濕性和類風濕性關節(jié)炎等疾病的主要有效成分，但也是雷公藤引起毒副作用的主要成分［3］。去甲澤拉木醛（demethylzeylasteral，DMZ）在三萜中含有量最高，具有一定的免疫抑制作用和抗炎作用，且毒性顯著低于甲素［4］。目前已上市的雷公藤制劑主要有雷公藤多苷片、雷公藤片、雷公藤雙層片和雷公藤總萜片等［5］，均為口服給藥劑型。雷公藤經皮給藥制劑具有安全性高、順應性好的特點，可以滿足臨床選擇需要，有較好的研究前景。

涂膜劑是藥物與成膜材料制成的供外用涂抹，能形成薄膜的局部液體制劑［6］。涂膜劑不僅制備工藝簡單，且使用后在用藥部位形成藥膜可保護創(chuàng)面，具有使用舒適和刺激性小等優(yōu)點，同時膜的形成減少了皮膚表面水分的蒸發(fā)，促進了水合作用和溶解角質作用，使藥物透過角質逐漸釋放藥物，延長藥效維持時間［7］，是一種很有發(fā)展前途的劑型。

1　儀器與材料

Waters（515-717-486）高效液相色譜儀（美國Waters公司）；RYJ-12B型藥物透皮試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；雷公藤浸膏粉（自制，批號為20130502，含DMZ 69.89 mg/g）；聚乙烯醇（PVA）-124（日本可樂麗）；DMZ純品（南通飛宇生物技術有限公司，批號為FY18540803，純度為99.35%）；高效液相所用試劑為色譜純，其他試劑為分析純。ICR小鼠（浙江省醫(yī)學科學研究院，SCXK（浙）-20140001）。

2　方法與結果

2.1涂膜劑基質的制備 按處方量稱取PVA-124，蒸餾水配成10%濃度，密封，冷水浸潤12 h，水浴80℃溶脹2 h后，取出放涼備用［8］。在攪拌下向PVA-124溶液加入處方量丙二醇溶液。緩慢加入處方量乙醇，攪拌使之分散均勻。最后加純化水至足量［9］，稀NaOH溶液調節(jié)pH至9，得黏稠狀涂膜劑基質。

2.2涂膜劑基質質量評價指標 以基質的流動性、成膜質量、外觀和成膜時間［10-11］作為指標進行評價。涂膜劑制備時攪動順暢，基質細膩，色澤一致，分散均勻，使用時薄膜完整、有韌性為6分；攪動較順暢，使用時薄膜連續(xù)為4分；攪動困難，基質有微量沉淀，使用時薄膜有破裂為2分。成膜時間：取涂膜劑1 mL均勻涂于皮膚上，每30 s考察1次，觀察并記錄成膜時間。綜合上述評價指標以總分確定最終基質處方（表1）［12］。

表1　涂膜劑基質質量評分標準Tab.1 Criteria for matrix of pellicle

2.3正交試驗優(yōu)化基質處方及其結果 經過預實驗，處方中PVA-124體積分數（A），丙二醇體積分數（B）和乙醇體積分數（C）三個因素對實驗結果影響較大，本實驗選擇L9（34）正交表優(yōu)化涂膜劑基質處方，觀察試驗樣品并取等量涂布于受試者的手背皮膚，采用“2.2”項下涂膜劑質量評價標準評價其質量，實驗結果見表2［12］，方差分析見表3。

表2　L9（34）正交試驗結果（n=3）Tab.2 Results of L9（34）orthogonal test（n=3）

表3　方差分析Tab.3 Variance analysis

根據實驗數據統(tǒng)計分析，以綜合評分為指標，實驗結果顯示因素影響的大小為A＞B＞C，其中因素A、B具有顯著影響（P＜0.05）；最佳工藝組合為A2B1C1。由于在正交水平范圍內乙醇體積分數對涂膜劑制備沒有顯著影響，且發(fā)現乙醇的體積分數與載藥量成正相關，為了增大涂膜劑的載藥量，并保證涂膜劑的質量，本實驗選用A2B1C2組合。

2.4雷公藤涂膜劑的制備 稱取適量的雷公藤浸膏粉溶于處方量的無水乙醇中。按“2.1”項制備方法，在正交試驗優(yōu)選的基質處方基礎上制備雷公藤涂膜劑。

2.5涂膜劑中去甲澤拉木醛的測定 稱取雷公藤涂膜劑0.5 g，置于錐形瓶中，使充分涂展，加入3 mL甲醇，震蕩并超聲處理5 min。多次提取至甲醇溶液無色澄清，涂膜劑殘留固體呈白色。提取液合并，定容至25 mL，過濾，按“3.1.2”項下色譜條件測定去甲澤拉木醛的量。

2.6雷公藤涂膜劑的載藥量研究 制備含雷公藤浸膏粉（10、15、20、25 mg/mL）的涂膜劑，按“2.2”項下評分標準，優(yōu)選雷公藤涂膜劑的載藥量。

實驗結果顯示含雷公藤浸膏粉15 mg/mL的雷公藤涂膜劑呈褐色稠狀溶液，體系分散均勻。平行制備3組進行評價，觀察其外觀、流動性，結果顯示其成膜時間1 min以內，成膜完整連續(xù)，涂布容易，均勻無沉淀。總分22分，滿足質量要求。

按“2.5”項下測定雷公藤涂膜劑中去甲澤拉木醛的的最大載藥量為（1.152±0.007）mg/g。

優(yōu)化后的處方工藝為稱取2.5 g PVA-124，蒸餾水配成10%濃度，密封，冷水浸潤12 h，水浴80℃溶脹2 h后，取出放涼備用。在攪拌下向PVA-124溶液加入2mL丙二醇溶液。緩慢加入15mL無水乙醇溶液（含0.75 g雷公藤浸膏粉），攪拌使之分散均勻。最后加純化水至足量，稀NaOH溶液調節(jié)pH至9，得稠狀雷公藤涂膜劑溶液。

3　雷公藤涂膜劑的透皮實驗研究

3.1去甲澤拉木醛在接受液中的分析方法學研究結合參考文獻［13］與課題組預實驗的結果建立HPLC法測定去甲澤拉木醛在接受液中的含量分析方法學。

3.1.1溶液的制備

3.1.1.1對照品溶液的制備 精密稱取去甲澤拉木醛對照品1.77 mg，加甲醇制成含去甲澤拉木醛28.32μg/mL的溶液，即得。

3.1.1.2供試品溶液的制備 取透皮接受液5 mL，過0.45μm濾膜，即得。

3.1.2接受液中去甲澤拉木醛的色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（55∶45）；檢測波長245 nm；柱溫室溫；體積流量1.000 mL/min。

3.1.3專屬性 取去甲澤拉木醛對照品，空白接收液及含藥接受液進高效液相色譜，結果顯示去甲澤拉木醛的分離度大于1.5，理論塔板數大于10 000。對照品、空白接受液和含藥接受液色譜圖見圖1。

圖1　去甲澤拉木醛對照品（A）、空白接受液（B）和含雷公藤接受液（C）的HPLC圖Fig.1 HPLC fingerprints of standard reference of DMZ（A），blank solution（B），and test solution w ith TWH（C）

3.1.4線性關系 精密稱取去甲澤拉木醛對照品，用接受液（PEG-400-無水乙醇-生理鹽水為1∶4∶5）［14］溶解并搖勻，得到28.32μg/mL的對照品接受液溶液。分別將不同體積的去甲澤拉木醛對照品接受液溶液進樣，在上述色譜條件下進行測定。以進入液相色譜儀的對照品質量為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，得回歸方程為Y=1.22×106X-26 636，r=0.999 9。線性范圍為0.028 4～2.84μg。

3.1.5回收率試驗 精密吸取6份等量透皮實驗透過液（含去甲澤拉木醛0.86μg），每份加入含去甲澤拉木醛1.09μg的對照品溶液，混合均勻。HPLC法分別進樣，測定并計算，去甲澤拉木醛在上述接受液中的平均回收率為99.8%，RSD為1.6%。

3.2雷公藤涂膜劑體外透皮性能研究

3.2.1離體鼠皮制備 取6只健康雄性小鼠（20± 2）g，用7%硫化鈉溶液（含5%甘油）活體脫去其背部毛發(fā)后用生理鹽水洗凈皮膚，擦干后飼養(yǎng)12 h。處死后剝離背部皮膚，剔除皮下脂肪和黏連物，用生理鹽水洗凈，使用前檢查皮膚有無破損［15］。

3.2.2體外透皮試驗 體外透皮試驗采用改良的Franz擴散池，上室為擴散室，下室為接收室，接收室的容積為7 mL，有效擴散面積為2.3 cm2，（37.0±1.0）℃恒溫水浴加熱，并以600 r/min磁力恒速攪拌。試驗時，在接收室內加滿接受液，將鼠皮固定在兩室之間，角質層朝上，使真皮層與接受液充分接觸，排除氣泡，由于涂膜劑使用的成薄膜的特殊性，所以雷公藤涂膜劑的加樣量為0.15 mL（含去甲澤拉木醛173μg）均勻涂布于皮膚上。分別于時間點2、4、6、8、10、12、24 h取5 mL接受液，并同時補加同樣體積的同溫新鮮接受液。接受液30 s內用0.45μm濾膜過濾，用HPLC測定去甲澤拉木醛的含量并計算累積滲透量Qn與累積透過率P。

累積滲透量Qn的計算公式為：

累積透過率P=［累積滲透量Qn/（雷公藤涂膜劑中去甲澤拉木醛質量濃度×加樣量））］100%

Qn為第n個取樣點的累積滲透量（μg），Cn、Ci為第n個和第i（i≤n-1）個取樣點的去甲澤拉木醛質量濃度（μg/mL），V0為接受液的體積（mL），V為取樣的體積（mL）。V0=7 mL，V=5 mL。結果見表4和圖2。

透皮實驗表明在10 h內涂膜劑呈零級釋放，釋放曲線為Qn=13.42t-18.84，r=0.995 5。滯后時間為1.4 h，滲透速率為4.86μg/h·cm2，累積透過率達64.32%。10 h之后去甲澤拉木醛的滲透速率逐漸下降，在24 h內去甲澤拉木醛釋放曲線符合Higuchi方程（Qn=43.70t1/2-42.60，r= 0.910 6），累積透過率達86.49%。

表4　透皮試驗結果（±s，n=3）Tab.4 Results of in vitro transdermal experiment（±s，n=3）

表4　透皮試驗結果（±s，n=3）Tab.4 Results of in vitro transdermal experiment（±s，n=3）

t/h Qn平均/μg平均累積透過率/% 2 5.79±1.24 3.33 4 34.78±8.40 20.02 6 64.92±10.70 37.38 8 90.85±11.08 52.31 10 111.89±11.17 64.43 12 126.93±9.78 73.08 24 154.21±9.20 86.49

圖2　雷公藤涂膜劑透皮累積滲透曲線（n=3）Fig.2 Transdermal cumulative distribution of Trigetrygium Wilfordii Hook.f extract pellicle（n=3）

4　討論

本實驗制備的涂膜劑以雷公藤浸膏粉為主藥，去甲澤拉木醛為指標物質，通過正交試驗對雷公藤涂膜劑的基質進行篩選，并建立涂膜劑質量評價標準，得到最優(yōu)處方工藝，制得質量較好的涂膜劑，同時對雷公藤涂膜劑進行了初步的透皮實驗研究。

PVA-124作為涂膜劑常用的成膜材料，具有極強的親水性與較好的生物相容性，能形成柔韌連續(xù)的薄膜；丙二醇作為增塑劑可使膜的柔成膜性能和抗拉強度增加，同時具有透皮促滲作用；乙醇為涂膜劑的重要成分，作用之一是溶解浸膏粉使之均勻分散在涂膜劑中，乙醇的量決定了涂膜劑的載藥量，但過量的乙醇會使PVA-124析出，另一方面作用是涂膜劑涂布于皮膚之后，乙醇的揮發(fā)使膜迅速生成。在試驗過程中必須注意的是將含雷公藤浸膏粉的乙醇溶液加入基質時，需不斷攪拌至混合均勻，防止PVA析出［12］。

為了科學客觀地評價涂膜劑的質量，需要建立更為完善與客觀的評價標準。涂膜劑的質量評價指標均采用直觀評價，以涂膜劑外觀、流動性、成膜時間與成膜質量為指標。涂膜劑外觀用于考察涂膜劑的均勻程度，流動性為涂膜劑使用時的涂布性能，成膜時間評價涂布后成膜的時間，反映了患者使用的順應性，成膜質量為藥膜涂布于皮膚后觀察成膜完整性、均勻度、有無氣泡及膜的柔韌性等。

透皮實驗研究時，發(fā)現去甲澤拉木醛在堿性環(huán)境下有更好的滲透性能。通過對涂膜劑進行初步透皮性能研究，結果顯示10 h內藥物呈零級釋放。24 h的滲透曲線符合Higuchi方程，表明去甲澤拉木醛從涂膜劑中釋放到被皮膚吸收的滲透曲線趨近于穩(wěn)態(tài)。雷公藤涂膜劑的24 h的透過率達86.49%，綜上所述，雷公藤涂膜劑的滲透穩(wěn)定持久、釋放率高，值得作為一種有臨床應用價值的新劑型而繼續(xù)深入研究。

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Preparation and in vitro transdermal behavior of Tripterygium Wilfordii Hook.f extract pellicle

ZHOU Mi1， XU Xiao-yong1， MA Feng-sen1，2*， LIANG Yi2
（1.School of Pharmacy，Zhejiang Uniυersity of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical Uniυersity，Hangzhou 310009，China）

Tripterygium Wifordii Hook.f（TWH）；demethylzeylasteral；pellicle；inυitro skin permeation

R944

A

1001-1528（2015）03-0526-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.014

2014-05-12

浙江省重大科技專項重點社會發(fā)展項目（2010C13014），浙江省“重中之重”學科（針灸推拿學）開放基金項目（ZTK2010A13）

周 密（1991—），女，從事藥物制劑新技術研究。Tel：15068856908，E-mail：zhoumi0930@126.com

馬鳳森（1962—），男，教授，從事藥物新劑型研究。Tel：（0571）88871500，E-mail：merrigen@126.com