苦蕎凝集素的純化及性質鑒定

申 劍，崔曉東，李玉英，王轉花*

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

苦蕎凝集素的純化及性質鑒定

申 劍，崔曉東，李玉英，王轉花*

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

目的：從苦蕎麥種子中提取、純化苦蕎凝集素，對其凝血及酶學活性等性質進行初步研究。方法： 采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀、透析及DEAE-纖維素陰離子交換層析（DEAE fast flow，DEAE FF）純化凝集素；高碘酸希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色鑒定其蛋白種類，硫酸-苯酚法測定糖含量；凝血實驗和糖抑制實驗檢測其凝血活性和結合糖特異性；以對硝基苯磷酸二鈉為底物，測定磷酸酯酶活性。結果：從苦蕎麥種子中獲得了一種具有凝血功能的蛋白質——苦蕎凝集素（tartary buckwheat lectin，TBL）。純化的TBL在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜上顯示單一條帶，根據SDS-PAGE計算其分子質量約為62 kD。PAS染色證明TBL為糖蛋白，糖含量為5.8%。凝血實驗表明TBL對人的O型血紅細胞具有特異性凝集作用，效價為15 μg/mL，對其他血型的紅細胞沒有凝血效應。血凝活性被D-甘露糖和D-葡萄糖抑制，推測其是一種甘露糖結合凝集素。酶學性質鑒定顯示，TBL具有磷酸酯酶活性，米氏常數Km= 9.86×10-3mol/L。結論：TBL可能是苦蕎麥種子中的一種具有多種酶學功能的甘露糖凝集素。

苦蕎；凝集素；糖蛋白；磷酸酯酶

凝集素是一類能與細胞表面的糖蛋白、糖脂中的寡糖結構可逆結合的天然蛋白，在自然界中分布非常廣泛［1-2］。舒曉燕等［3］報道，早在1888年，Herman Stillmark在蓖麻籽中發現了具有細胞毒性的凝集素，命名為蓖麻毒素（ricin）。經過數十年的研究，Ricin的線性一維和空間結構已經清楚，由于其具有很強的抑制蛋白質合成和細胞毒性等功能，已被廣泛用于抗癌免疫毒素和作為生物殺蟲劑［4］。1916年，Jones等［5］首次從直生刀豆中分離出一種能特異性結合甘露糖/葡萄糖的凝集素-伴刀豆球蛋白（concanavalin A，Con A）。隨后，Con A的結晶體和三級結構陸續被解析，從而揭開了研究植物凝集素分子結構和功能的序幕［6-7］。目前，凝集素的研究主要包括凝集素的分類，糖結合特性及生物活性等［8］。凝集素最顯著的特征是能與紅細胞表面特異糖基發生專一性結合，使紅細胞發生凝集，發揮其生物學功能［9］。此外，凝集素在生物識別、胚胎發育、癌癥和免疫應答等方面都起著重要作用［10］。根據氨基酸序列同源性及其在進化上的關系，植物凝集素可以分為以下7 個家族：豆科凝集素、幾丁質結合凝集素、單子葉甘露糖結合凝集素、Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素以及莧科凝集素［11］。RIP不僅具有凝血活性，還有RNA-水解酶、RNA N-糖苷酶和水解超螺旋環狀DNA的酶活性等許多生物酶活性，是一種具有酶活性的特殊凝集素［12］。目前人們已經從10多個科，大約50多種植物中得到了RIPs，并對這些特殊凝集素的理化性質等進行了相應的研究。但是有關蕎麥中的凝集素的制備及凝血作用等研究尚未見報道。

蕎麥是一種重要的蓼科雜糧作物，也是一種傳統的藥食同源植物［13］，被譽為“五谷之王”。苦蕎麥所含蛋白質及氨基酸種類豐富，其中賴氨酸含量高達0.69%，為大米的2.7 倍［14］。有報道證明，蕎麥中的礦物質鉀、鎂、銅、鋅、鈣、錳等元素的含量也高于大宗糧食作物。蕎麥的化學成分獨特，生物類黃酮含量較高，這些黃酮類物質具有明顯的降血脂、降血糖以及降尿糖作用［15-16］，對高血脂、腦血管硬化、心血管病和高血壓等癥有積極的預防和治療作用，在調理和預防疾病中有良好的藥用價值。近年來，隨著人們對蕎麥食產品在保健和輔助藥物治療中的獨特作用，有關蕎麥中的抗營養因子，蛋白酶抑制劑及特異性抗原等功能蛋白的研究也取得了長足進展。本課題組的前期研究發現來自蕎麥中的蛋白酶抑制劑rBTI具有一定的抗腫瘤作用，能明顯抑制肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡或自噬［17-18］。蕎麥中的多肽表現出了抗菌、抗腫瘤等生物活性［19-20］，而蕎麥中的過敏原能致接觸或食用者產生哮喘等過敏癥狀［21］。但有關蕎麥中的更多生物活性成分，包括凝集素及其在植物源凝集素中的分類、功能等的研究還有待揭示。本實驗首次采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀、透析及DEAE-纖維素陰離子交換層析（DEAE fast flow，DEAE FF）等方法獲得一種具有凝血活性的苦蕎麥凝集素（tartary buckwheat lectin，TBL），并對其酶學活性及糖結合專一性等性質進行了初步研究。這為深入研究凝集素的生物學功能及應用提供了理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

苦蕎麥種子為云蕎一號，由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所饋贈；凝血實驗所用人A、B、AB及O型血采自志愿者。

96孔U型板 丹麥Nunc公司；DEAE FF離子交換層析柱（1 mL） 美國GE Healthcare公司；堿性品紅、對硝基苯磷酸二鈉（4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate，pNpp） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

BL310電子天平 德國賽多利斯公司；TB20-1000梯度攪拌器 上海新波無線電公司；5417 R離心機德國艾本德公司；CR 22G Ⅱ高速離心機 日本日立公司；恒溫水浴鍋 太倉儀器廠；756MC紫外-可見分光光度計 上海光學儀器廠；PowerPac 300電泳儀 美國伯樂公司；AKTA Explorer蛋白純化系統 美國通用電氣公司。

1.3方法

1.3.1TBL的分離純化

苦蕎麥種子脫殼粉碎，過40 目篩，稱取100 g粉末于燒杯中，加入1 L 20 mmol/L、pH 5.0 的乙酸銨-乙酸緩沖液，冷水浴4 ℃攪拌抽提6 h，8 000 r/min 離心30 min除去沉淀，上清液中緩慢、均勻地加入固體硫酸銨，使之飽和度達到80%，即質量濃度達到559 g/L，4 ℃攪拌6 h。8 000 r/min 離心30 min收集沉淀，用80 mL 20 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重新溶解沉淀，并用相同緩沖液透析，除去硫酸銨。得到的粗品上樣于DEAE FF柱，在AKTA Explore進行純化，平衡液為20 mmol/L、pH 7.0的PBS，洗脫液為20 mmol/L、pH 7.0的PBS和0.5 mol/L的NaCl，流速為1 mL/min，收集洗脫峰并進行活性檢測。純化得到的TBL采用Folin-酚法進行蛋白質量濃度測定，分裝于1.5 mL離心管中備用。

1.3.2十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分析

參考Laemmli［22］方法進行，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為4%，考馬斯亮藍R250進行染色，電泳結果采用Gene Genius Bio Imaging System 拍照進行分析。以標準蛋白分子質量對數值（lgMr對相對遷移距離做標準曲線，得回歸方程為y=-1.388 7x+2.514 0（R2=0.997 1）。根據電泳結果按照下式計算相對遷移率，通過樣品的遷移率計算分子質量。

1.3.3高碘酸希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色及糖含量測定

糖蛋白鑒定采用PAS染色法［23］。首先進行SDSPAGE，膠用10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）處理5 min；再用1%高碘酸處理15 min；之后蒸餾水洗3 次，每次5 min；倒入Schiff試劑避光染色30 min；再用0.5%偏重亞硫酸鈉漂洗3 次，每次5 min；于7%乙酸溶液中保存。糖含量測定采用硫酸-苯酚法［24］，以葡萄糖為標準。

1.3.4TBL的凝血活性測定

取適量人A、B、AB及O型血分別用20 mmol/L的PBS漂洗數次，每次2 000 r/min離心5 min，去上清液，按紅細胞壓積用PBS配制成2% PBS-紅細胞懸浮液。按照文獻［25］操作，血凝板各孔加入PBS 25 μL，第二列加入25 μL、質量濃度為60 μg/mL的TBL，逐行進行倍比稀釋，最后每孔中加入25 μL不同血型的2%紅細胞懸浮液，在微型振蕩器振蕩2 min，室溫靜置30 min后觀察結果。以能使紅細胞發生凝集反應的TBL的最小質量濃度為效價。

由表中結果可知，灼燒樣品時間大于40 min后燒失量的測定結果與樣品反復灼燒所測得的結果相差很小，因而為了節約時間和成本，試驗操作時可以灼燒樣品40 min左右進行結果測定。

1.3.5糖抑制實驗

將D-甘露糖、D-葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖及L-巖藻糖分別溶于PBS緩沖液中，配制成400 mmol/L的糖溶液。血凝板各孔中加入PBS 25 μL，在第一列各孔中加入25 μL不同糖溶液（并進行倍比稀釋）及25 μL的TBL，室溫孵育5 min，以下操作同1.3.4節。糖的結合能力以抑制TBL血凝活性的最低糖濃度為標準。每種糖溶液的抑凝實驗重復3 次。

1.3.6磷酸酯酶活性測定

參照文獻［26］方法，以pNpp（對硝基苯磷酸二鈉）為底物，檢測TBL磷酸酯酶活性。反應總體積為5 mL：3 mL 0.2 mol/L CH3COONa-CH3COOH pH 5.0緩沖液，1 mL 10 mmol/L的MgSO4及1 mL不同濃度（5、10、15、20、25、30 mmol/L）的底物pNpp。在37 ℃下，預熱5 min，加100 μL酶液，反應10 min，然后用2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應，以蒸餾水代替酶液作對照，在420 nm波長處測光密度值。酶活力單位定義為：在37 ℃條件下，以pNpp為底物，每升酶液每分鐘水解底物后生成產物的微摩爾數作為一個酶活力單位（U）。按照Lineweaver Burk作圖法求出該酶的米氏常數（Km）值。

2　結果與分析

2.1TBL的DEAE FF層析分離及純度和分子質量鑒定

圖1　TBL的離子交換層析圖譜Fig.1 Ion exchange chromatography of TBL

由圖1可知，經20 mmol/L、pH 7.0的PBS和0.5 mol/L的NaCl洗脫后，在18.6～21.0 mL范圍內出現TBL特征吸收峰。將收集的目的蛋白進行純度分析，結果見圖2，TBL經膠質量分數為12%的SDS-PAGE分離后呈現單一條帶，純度達到95%以上。純化的蛋白可滿足后續活性分析等，經計算得TBL的分子質量約為62 kD，與預期結果一致。

圖2　TBL的SDS-PAGE分析結果Fig.2 SDS-PAGE analysis and molecular weight determination of TBL

2.2PAS染色鑒定TBL及糖含量的測定結果

圖3　TBL的考馬斯亮藍R250染色和PAS染色結果Fig.3 Coomassie brilliant blue R250 staining and PAS staining of TBL

2.3TBL的凝血活性

圖4　TBL對人不同血型（A、B、AB及O）的血凝反應Fig.4 Hemagglutination reaction of TBL on different human blood types

通常發生血凝反應的紅細胞應均勻地分布在孔中，未凝集的應在孔底沉積呈小紅點狀。如圖4所示，第一列為對照組（呈小紅點累積于孔底），A、B和AB型血實驗組（第二列之后）與對照組相比均未發生血凝反應。O型血第二列全部凝集，第三列部分凝集，第三列以后的紅細胞未凝集，而是沉降于孔底，形成紅色圓點，表明第三列之后的TBL質量濃度不足以發生血凝效應。實驗結果證明TBL可以特異性地凝集人的O型血，血凝效價為15 μg/mL。TBL對不同血型血凝效果見表1。

表1　TBL對不同血型血凝效果Table1 Effect of TBL concentration on hemagglutination of different human blood types

2.4TBL的特異結合糖類型

目前已知的植物凝集素均可以特異性地與糖結合，且細胞表面糖類都可以被某種凝集素所識別。本研究選擇5 種單糖分別和紅細胞懸液作用，觀察并分析在不同稀釋倍數下對TBL的凝血抑制作用，從而確定苦蕎凝集素結合單糖的特異性。由表2可知，D-甘露糖（D-mannose）和D-葡萄糖（D-glucose）在濃度為66 mmol/L時，可以完全抑制TBL的血凝活性，而D-半乳糖（D-galactose）、N-乙酰氨基葡萄糖（GluNAc）及L-巖藻糖（L-fucose）未能完全抑制TBL的血凝活性。結果表明，TBL的血凝活性可能被D-甘露糖和D-葡萄糖特異性抑制。從而推斷來源于苦蕎麥中的凝集素屬于D-甘露糖凝集素。

表2　TBL糖抑制實驗結果Table2 Hemagglutination-inhibitory activity of TBL

2.5TBL的磷酸酯酶活性

圖5　TBL的磷酸酯酶活性Fig.5 Lineweaver-Burk plot for phosphatase activity of TBL

有研究表明來源于植物體內的部分凝集素有磷酸酯酶等酶活性，為了初步判斷TBL的酶活性功能，實驗以pNpp為底物，研究TBL的磷酸酯酶活性。pNpp是一種小分子化合物，若被測物質具有磷酸酯酶活性，在適宜的反應條件下，pNpp會脫去一分子磷酸，生成的硝基酚黃色化合物在420 nm波長處有特征吸收。實驗結果表明，在37 ℃水浴10 min的條件下，與對照組相比，TBL與pNpp發生了明顯反應，可將pNpp水解成硝基酚，證明其具有磷酸酯酶活性。以1/v對1/［S］作圖，結果如圖5所示，從圖中求出TBL的磷酸酯酶活性的Km為9.86×10-3mol/L。已知草魚酸性磷酸酯酶和斑玉蕈磷酸酯酶Ⅰ、酶Ⅱ與pNpp反應的Km分別為3.56×10-3、4.095×10-3mol/L和36.3×10-3mol/L［26-28］。本實驗獲得的TBL的磷酸酯酶的米氏常數與上述幾種來源的酶相當，表明對底物pNpp的親和力相近。但與蕹菜類囊體膜磷酸酯酶的米氏常數（Km為1.76×10-6mol/L）相比［29］，TBL對底物pNpp的親和力較低。不同磷酸酯酶對pNpp反應的米氏常數的差異可能與蛋白質結構、性質及酶作用專一性等有關。詳細酶活性及催化機理有待進一步研究。

3　討 論

近年的研究表明，凝集素作為一種蛋白質或糖蛋白，能與糖專一地、非共價地可逆結合。部分凝集素除了具有凝集細胞和沉淀聚糖或糖復合物的作用外［30］，還具有多種酶性功能，能選擇性地水解不同底物，如Ⅱ型核糖體失活蛋白類凝集素［31］，由于其結構的特殊性，使其既具有N-糖苷酶活性（結構中的A鏈），又具有凝集素的特性（結構中的B鏈），依靠其糖結合活性可使Ⅱ型核糖體失活蛋白結合于哺乳動物細胞表面，觸發受體介導的細胞內吞作用，進入細胞后，A鏈選擇性地水解真核生物28S核糖體RNA，從而抑制蛋白質合成的肽鏈延伸過程，說明此類凝集素具有酶的催化活性。

本實驗采用粗提及離子交換柱層析等步驟，首次從苦蕎麥種子中獲得一種分子質量約為62 kD的蛋白質。通過優化粗提緩沖體系，發現采用生理鹽水或PBS提取TBL均不能獲得滿意的提取率，而以20 mmol/L、pH 5.0乙酸銨-乙酸緩沖液作為溶劑時，TBL的提取質量和活力都最高，說明不同的緩沖體系對植物源凝集素的提取效果有明顯的影響。獲得的粗蛋白經DEAE FF離子交換層析柱一步分離純化即可獲得純度達95%以上的TBL蛋白。純化的蛋白經血凝實驗證明其具有血凝活性，對人的O型血的血凝效價為15 μg/mL。糖抑制實驗表明，TBL血凝活性可被D-甘露糖和D-葡萄糖特異性抑制，推測其可能屬于D-甘露糖凝集素（mannose binding lectin，MBL）。為了揭示本研究獲得的TBL的生物學功能，實驗中以pNpp為底物，初步探討了其酶性功能，結果表明，TBL能水解底物中的磷酸酯鍵，具有磷酸酯酶的活性。經比較，發現TBL的催化活性與草魚中的酸性磷酸酯酶［26］和斑玉蕈磷酸酯酶Ⅰ、酶Ⅱ［28］的作用類似。

目前已知的植物凝集素種類較多，功能各異，根據其來源、作用方式以及氨基酸系列同源性等命名的7 個家族中，具有磷酸酯酶活性的植物凝集素僅在Ⅱ型核糖體失活蛋白中發現。本實驗初步表明TBL具有磷酸酯酶的活性，同時還具有切割質粒DNA的活性，經TBL作用后的質粒可產生線性DNA和缺刻環DNA（數據未附），說明該蛋白具有類似Ⅱ型核糖體失活蛋白的功能，但有關苦蕎麥凝集素是否具有其他酶學特性，TBL的結構與功能之間的關系等還需要對其RNA-水解酶、RNA N-糖苷酶和水解超螺旋環狀DNA的酶活性及結構和性質等進行深入研究。

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Purification and Identification of Tartary Buckwheat Lectin

SHEN Jian， CUI Xiaodong， LI Yuying， WANG Zhuanhua*
（Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering， Ministry of Education， Institute of Biotechnology，Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Purpose： To purify lectin from tartary buckwheat （TBL） and identify its hemagglutination and enzymatic activity. Methods： TBL was extracted and purifi ed by ammonium sulfate precipitation， dialysis， and anion exchange chromatography. Periodic acid-Schiff （PAS） staining was used to identify its glycoprotein nature and sulfuric acid-phenol method was used to measure the sugar contents. The hemagglutination activity and sugar binding specifi city of the purifi ed TBL were tested by hemagglutination reaction and hemagglutination inhibition assays， and the phosphatase activity was measured by using 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate （pNpp） as the substrate. Results： The purifi ed TBL displayed a single band and a molecular weight of 62 kD， as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDSPAGE）. PAS staining indicated that TBL was a glycoprotein with a sugar content of 5.8%. Hemagglutination reaction demonstrated that TBL could agglutinate the O type of human blood with titer of 15 μg/mL. The hemagglutination activity was inhibited by D-glucose and D-mannose， from which， TBL can be deduced as a mannose-binding lectin. Further experiments demonstrated that TBL had phosphatase activity with a Michaelis constant Kmof 9.86×10-3mol/L. Conclusions：The TBL obtained in this study was a mannose-binding lectin （MBL） with enzymatic functions.

tartary buckwheat； lectin； glycoprotein； phosphatase

Q556

A

1002-6630（2015）03-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201503001

2014-08-27

國家自然科學基金面上項目（31171659）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31300653）；山西省科技創新項目（2014091028）

申劍（1989—），男，碩士研究生，研究方向為蛋白質化學與工程。E-mail：419139257@qq.com

王轉花（1956—），女，教授，博士，研究方向為蛋白質工程與生物活性物質。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn