酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的分離與穩定性研究

丁順杰，羅金鳳，丁曉雯，黃先智*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；2.西南大學蠶學與系統生物學研究 所，重慶 400715）

酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的分離與穩定性研究

丁順杰1，羅金鳳1，丁曉雯1，黃先智2，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；2.西南大學蠶學與系統生物學研究 所，重慶 400715）

目的：研究酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的分離和穩定性，為其開發應用提供基礎數據。方法：超濾分離酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽，比色法測定其抗氧化能力。結果：超濾分級后得到分子質量為200～3 000 D的酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽對O2-?、?OH、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的IC50分別為18.85 mg/mL、3.13 mg/mL、35.23 μg/mL。該抗氧化肽經過4 h胃蛋白酶+胰蛋白酶處理前后對DPPH自由基清除率分別為81.05%、82.26%；在pH 4、8條件下處理1 h，對DPPH自由基清除率分別為98.02%、11.80%（100 μg/mL）；在溫度95 ℃條件下處理1 h，對DPPH自由基清除率為87.11%（100 μg/mL）；用濃度為1.0 mol/L的NaCl處理6 h，相比對照組，對DPPH自由基清除率由51.58%下降到22.68%（60 μg/mL）。結論：超濾后得到的分子質量為200～3 000 D的酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化能力比酶解原液有一定提高；且在酸性、高溫、脫鹽處理后對DPPH自由基的清除能力保持較好；胃腸道消化酶對其DPPH自由基清除能力的影響不顯著（P＞0.05）。

酶解繅絲蠶蛹蛋白；抗氧化肽；分離純化；穩定性

機體氧化產生的自由基與人體衰老及許多疾病有關［1-2］。抗氧化肽由于其良好的抗氧化活性、低毒性、分子質量小、易吸收等特性而成為近年來研究的熱點之一［3］。我國是世界最大的蠶繭生產國，年產鮮繭60余萬 t［4］。蠶蛹是蠶繭繅絲后的主要副產物，其蛋白質含量豐富，占干蠶蛹質量的45%～55%［5］。蠶蛹蛋白質含有18 種氨基酸，其中8 種人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的40%以上，高于世界衛生組織與聯合國糧農組織提出的參考蛋白模式，且比例適當，是一種優質、豐富的蛋白源［6-7］。由于繅絲蠶蛹的理化、功能性質發生了改變和特殊腥味，不宜作為食品直接食用，因此目前繅絲蠶蛹多作為動物飼料，使其附加值沒能得到充分發揮，如何更好地開發利用繅絲蠶蛹蛋白成為推動我國蠶桑產業發展的關鍵環節之一。

近年來，利用酶工程技術將蠶蛹蛋白開發為生物活性肽的研究時有報道［8-11］，本實驗室也通過酶處理技術對繅絲蠶蛹蛋白進行分解，得到了有較強抗氧化能力的肽混合物。本實驗采用超濾分離技術，對酶解后的繅絲蠶蛹蛋白肽進行分離，考察得到的各組分抗氧化活性并對它們對多種理化因素的穩定性進行評價，為繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的深入開發提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

脫脂繅絲蠶蛹蛋白：自制。將干燥的繅絲蠶蛹粉碎，以石油醚作溶劑用索式提取器抽提12 h以去除其中的脂肪，將剩余物干燥、粉碎而得脫脂蠶蛹蛋白粗粉。

繅絲蠶蛹蛋白水解專用酶（酶活力為105U/g） 南寧東恒華道生物科技有限公司；牛血清白蛋白 上海伯奧生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-酚美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

MSM-2008實驗用超濾微濾膜分離裝置、HPS-3聚醚砜卷式超濾柱、RO-1812芳香聚酰胺卷式納濾柱 上海摩速科學器材有限公司；SHZ-Ⅲ真空泵 上海亞榮生化儀器廠；UV2000紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；ALPAAI-4LIC真空冷凍干燥機 美國Sigma-Aldrich公司；HD-5電腦核酸蛋白（紫外）檢測儀、HL-2恒流泵、CBS-A程控全自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；Elix10純水機、Milli-Qbiocel超純水機 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的制備

根據本實驗室前期的研究結果，取脫脂繅絲蠶蛹蛋白粗粉配制成7%的酶解底物，用1 mol/L的NaOH調節pH值為7.2，按質量分數3%的加酶量加入繅絲蠶蛹蛋白水解專用酶，53 ℃酶解4 h。酶解過程中不斷滴加1 mol/L的NaOH或HCl以維持pH值穩定。沸水浴10 min滅酶結束酶解，流動水冷卻，4 000 r/min離心15 min，收集上清液冷凍備用。測得上清液還原力吸光度為0.75，O2-?和DPPH自由基清除率分別為34.54%和79.38%。

1.3.2繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的超濾分級

抽濾：將繅絲蠶蛹蛋白酶解液用0.45 μm有機濾膜抽濾，去除酶解液中的大顆粒雜質。超濾：將抽濾后酶解液上超濾分離裝置進行超濾。超濾條件為壓強0.25 MPa、常溫，用截留分子質量為3 000 D有機超濾膜處理，得到分子質量大于3 000 D和小于3 000 D的超濾片段；將后者再用截留分子質量為100～200 D的有機濾膜處理，超濾條件為壓強0.4 MPa、常溫，得到分子質量為200～3 000 D組分和分子質量小于200 D的組分。收集酶解原液、分子質量大于3 000 D組分和200～3 000 D組分進行真空冷凍干燥，作為抗氧化活性檢測樣本備用。

1.3.3繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽抗氧化能力評價

1.3.3.1還原力的測定

參考Oyaizu［12］的鐵氰化鉀還原法測定還原力。將酶解原液、分子質量大于3 000 D和200～3 000 D的酶解組分分別配成0.1、0.3、0.5、1.0、2、5、10 mg/mL的溶液，同時分別配制0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的VC溶液，作為陽性對照，在700 nm波長處測定吸光度。

1.3.3.2超氧陰離子自由基（O2-?）清除能力的測定

將酶解原液、分子質量大于3 000 D和200～3 000 D組分分別配成0.5、1、2、5、10、20、30 mg/mL的溶液，同時分別配制0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的VC溶液，作為陽性對照。

測定方法參考文獻［13-14］加以改進。吸取繅絲蠶蛹蛋白肽稀釋液1.0 mL，加入2.5 mL的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），混勻，在25 ℃水浴保溫10 min后加入10 μL 50 mmol/L的鄰苯三酚（25 ℃水浴預熱），迅速混勻并開始計時，每隔30 s在320 nm處測定吸光度A320nm，5 min后結束測定。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為繅絲蠶蛹蛋白酶解液對鄰苯三酚自氧化速率v2；以蒸餾水作空白對照，其斜率為蒸餾水鄰苯三酚自氧化速率v1，按照公式（1）計算O2-?清除率，由對O2-?的清除率計算半數清除濃度（IC50）。

1.3.3.3羥自由基（?OH）清除能力的測定

［15-16］中的方法進行測定。將酶解原液、分子質量大于3 000 D和200～3 000 D組分分別配成0.5、1、2、5、10、20、30 mg/mL的溶液，同時分別配制0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的VC溶液，作為陽性對照，由對?OH的清除率計算出其對?OH的IC50。

1.3.3.4DPPH自由基清除能力的測定

測定方法參考文獻［17-18］加以改進。將酶解原液、分子質量大于3 000 D和200～3 000 D組分分別配成10、20、40、60、80、100、120、140、160、200 ?g/mL的溶液，同時分別配制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的VC溶液，作為陽性對照。分別取3.0 mL繅絲蠶蛹蛋白酶解液于試管中，加入3.0 mL 20 μg/L DPPH自由基溶液（乙醇配制，避光保存）搖勻，放置30 min后在517 nm波長處測定其吸光度。在相同反應體系下分別測定空白對照組、樣品顏色組干擾的吸光度，按照公式（2）計算DPPH自由基的清除率，由對DPPH自由基的清除率計算出其對DPPH自由基的IC50。

式中：A1為空白對照組的吸光度；A2為樣品組吸光度；A3為樣品顏色組干擾的吸光度。

1.3.4200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽穩定性檢測

1.3.4.1對消化酶的穩定性檢測［19］

對胃蛋白酶的穩定性：模擬人體自然生理消化過程，用pH 2.0 HCl-KCl緩沖液配制樣品，根據樣品質量，加入質量分數1%的胃蛋白酶，在37 ℃酶解3 h，酶解結束后在沸水浴中加熱10 min終止反應，流動水冷卻，5 000 r/min離心15 min，取上清液測定其對DPPH自由基的清除率，并做空白對照。

對胰蛋白酶的穩定性：在經過胃蛋白酶處理后的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽中加入質量分數1%的胰蛋白酶，在37 ℃、pH 8.0條件下酶解3 h，在沸水浴中加熱10 min終止反應，流動水冷卻，5 000 r/min離心15 min，取上清液測定對DPPH自由基的清除率，并做空白對照。

1.3.4.2對pH值變化的穩定性檢測

將繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽樣品分別溶于pH值為2、4、6、8、10、12的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中配成質量濃度為100 μg/mL的溶液，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節至相應pH值，用蒸餾水作對照，37 ℃保溫5 h，每1 h測定其對DPPH自由基的清除率。

1.3.4.3對溫度變化的穩定性檢測

將繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽樣品溶于超純水中配成質量濃度為100 μg/mL的測試液，置于溫度分別為25、35、45、55、65、75、85、95 ℃水浴保溫3 h，室溫作對照。每30 min取樣在冰水浴中迅速冷卻到室溫，測定其對DPPH自由基的清除率。

1.3.4.4對NaCl溶液的穩定性檢測

將繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽樣品用濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L的NaCl溶液配制為60 ?g/mL的溶液，室溫放置6 h，每1 h取樣測定其對DPPH自由基的清除率。以蒸餾水作對照。

1.4數據處理

實驗結果為3 次重復實驗的平均值，采用Excel 2007、SPSS 17.0進行數據分析。

2　結果與分析

2.1超濾分級前后酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化能力評價

2.1.1超濾分級前后各組分的還原力

多項研究表明，抗氧化活性與還原力存在正相關［20-22］。還原力可表示抗氧化物質提供電子的能力，還原能力強的物質是良好的電子供體，可以與自由基反應，通過提供電子使自由基變為穩定的物質，從而阻斷自由基的鏈式反應，為物質清除活性氧等自由基或發揮抗氧化作用提供了可能［23］。

圖1　超濾分離前后各組分的還原力Fig.1 Reducing power of the hydrolysate and its ultrafiltration fractions

由圖1可知，繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽超濾分離前后各組分的還原力隨著質量濃度的增加逐漸增大，存在明顯的劑量-效應關系；達到一定質量濃度后，還原力不再增大。在質量濃度低于5 mg/mL時，分子質量為200～3 000 D組分的還原力高于酶解原液和分子質量大于3 000 D的組分；當質量濃度大于5 mg/mL后，酶解原液、分子質量大于3 000 D組分和200～3 000 D組分的還原力達到最高水平，吸光度為2.74且無顯著性差異（P＞0.05），與VC的最高還原力（A700nm=2.86）無顯著性差異（P＞0.05）。由此可見，在相對較低的質量濃度范圍內，超濾后分子質量在200～3 000 D組分的還原力最高。

表1　超濾分級前后各組分及VC由基的ICTable1 ICthe hydrolysate and its ultrafiltration fractions in comparison to VC for scavenging three kinds of free radicals

表1　超濾分級前后各組分及VC由基的ICTable1 ICthe hydrolysate and its ultrafiltration fractions in comparison to VC for scavenging three kinds of free radicals

注：*. 與酶解原液相比，差異顯著（P＜0.05）；**. 與酶解原液相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

不同組分VC酶解原液＞3 000 D組分200～3 000 D組分對O2-?的IC50/（mg/mL）0.03**17.94 23.59*18.85對?OH的IC50/（mg/mL）0.23**4.04 5.10* 3.13*對DPPH自由基的IC50/（μg/mL）2.09**53.77 96.73**35.23**

由表1可知，酶解繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽超濾后，對O2-?清除活性，分子質量大于3 000 D繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽有顯著性降低（P＜0.05），200～3 000 D的組分變化無顯著性差異（P＞0.05），這與王璇［16］的研究結果基本一致；對?OH清除活性，分子質量大于3 000 D的組分有顯著性降低（P＜0.05），分子質量為200～3 000 D的組分繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽有顯著性提高（P＜0.05）；對DPPH自由基清除活性，分子質量大于3 000 D的組分有極顯著性降低（P＜0.01），分子質量為200～3 000 D繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽有極顯著性提高（P＜0.01）。

對繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽超濾前后各組分對4種自由基的清除能力的測定結果表明，在一定質量濃度范圍內，分子質量為200～3 000 D繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的還原力、?OH、DPPH自由基的清除活力顯著（P＜0.05）高于酶解原液和分子質量＞3 000 D的組分，但遠弱于VC抗氧化性；IC50值越小，自由基清除能力越強，其清除自由基能力大小順序為DPPH自由基＞?OH＞O2-?。且在研究的質量濃度范圍內，隨著質量濃度增大，其清除能力也增大，具有較好的量效關系。因此有必要對分子質量為200～3 000 D的組分進行穩定性評價。

2.2繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽（200～3 000 D）的穩定性評價

2.2.1胃腸道消化酶對抗氧化肽穩定性的影響

消化酶是參與消化的酶的總稱，其作用是將大分子物質水解為小分子物質從而被人體吸收，同時也會使部分肽類物質結構發生改變，影響其生理活性。為了解分子質量為200～3 000 D繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽對抗消化酶的能力，通過體外模擬人體胃腸道消化系統測定其對DPPH自由基清除率變化來評價其對胃蛋白酶、胰蛋白酶的抵抗能力。

表2　200～3 000 D組分經胃腸道消化酶處理前后對DPPH自由基清除率比較Table2 Comparisons of DPPH radical scavenging activities of 200-3 000 D peptides after being digested by pepsin alone or in combination with trypsin

由表2可知，200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽組分經胃蛋白酶水解后，對DPPH自由基的清除率下降了2.58%，無顯著性差異（P＞0.05）；經胃蛋白酶與胰蛋白酶處理后，對DPPH自由基的清除率增加了1.11%，也未有顯著性差異。實驗結果表明，分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽能夠耐受腸道蛋白酶的作用，可能被人體直接吸收而參與人體的抗氧化過程。

2.2.2pH值對抗氧化肽穩定性的影響

將分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽組分溶于不同pH值的緩沖溶液中，研究它們在不 同pH值條件下5 h內對DPPH自由基清除率的變化。

圖2　pH值對200～3 000 D組分的DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of pH on DPPH radical scavenging activity of 200-3 000 D peptides

由圖2可知，pH＜4時，分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽對DPPH自由基清除能力隨pH值增加而增加，pH 4時達到最大（100 μg/mL清除率98.02%）；之后隨著pH值增大，對DPPH自由基清除能力逐漸減小，pH 8時，處理1 h，DPPH自由基清除率最低為（11. 80±0.45）%。時間對其DPPH自由基清除率影響不顯著。結果表明，在pH 2～7環境下，分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽對DPPH自由基清除能力相對較高且穩定，而在堿性環境中，其對DPPH自由基清除能力降低。

2.2.3溫度對抗氧化肽穩定性的影響

由圖3可知，分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽在45 ℃條件下具有較高的DPPH自由基清除活性，清除率為86%左右；隨著溫度的升高，DPPH自由基清除活性降低，溫度為75～85 ℃時，清除能力降到最低，清除率為80%左右；當溫度高于85 ℃后，清除活性得以恢復，在95 ℃條件下處理1h，對DPPH 自由基清除率為87.11%（100 μg/mL），且加熱時間對其清除率沒有顯著性影響。這說明，在一定范圍內溫度對分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白肽對DPPH自由基清除率影響不明顯，它們可以耐受加工過程較高溫度的處理。

圖3　溫度對200～3 000 D組分DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of 200-3 000 D peptides

2.2.4NaCl濃度對抗氧化肽穩定性的影響

由于食品加工過程經常用到NaCl，將分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白肽分別溶于0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L的NaCl溶液中，考察它們6 h內DPPH自由基清除率的變化，實驗結果如圖4所示。

圖4　NaCl濃度對200～3 000 D組分DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on DPPH radical scavenging activity of 200-3 000 D peptides

由圖4可知，不同濃度的NaCl對繅絲蠶蛹抗氧化肽對DPPH自由基清除率有較大影響。樣品對DPPH自由基清除率呈現降-升-降的波動趨勢。當NaCl為0、0.2、0.8 mol/L時，出現樣品對DPPH自由基清除活性高峰；當NaCl濃度高于0.8 mol/L后，樣品對DPPH自由基清除活性迅速降低，用1.0 mol/L的NaCl處理6 h，相比對照組，繅絲蠶蛹抗氧化肽對DPPH自由基清除率由51.58%下降到22.68%（60 μg/mL）。5 h和6 h處理時間對0.4、1.0 mol/L NaCl中樣品DPPH自由基清除率有較大降低。由此可見，脫鹽處理能較好保證分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白肽的抗氧化性。

3　結 論

研究超濾分級后水解產物的還原力與清除自由基能力大小，分子質量200～3 000 D的抗氧化肽具有較好抗氧化活性，且大于酶解原液與分子質量大于3 000 D組分，其清除自由基能力由大到小為：DPPH自由基＞?OH＞O；在一定質量濃度范圍內，其總還原力、O、?OH、DPPH自由基的清除能力隨著其質量濃度增加而增加。

胃腸道消化酶 處理后對其DPPH自由基的清除率影響不明顯，該抗氧化肽可能被人體胃腸道正常吸收而參與抗氧化過程；分子質量200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除能力在酸性環境下較高且穩定，而在堿性環境下較低；繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽耐熱性較好，95 ℃加熱3 h，DPPH自由基清除率仍保持80%以上；NaCl濃度對其DPPH自由基清除能力的影響趨勢呈現波動性，NaCl濃度為0、0.2、0.8 mol/L時，繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除活性較高為53%左右（60 μg/mL）。

后續研究將對200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白抗氧化肽采用柱層析法進一步分離純化，對分離得到的新組分進行分子質量鑒定和抗氧化能力的深入研究。

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Separation and Stability of Antioxidant Peptides from Silkworm Pupa Protein by Enzymatic Hydrolysis

DING Shunjie1， LUO Jinfeng1， DING Xiaowen1， HUANG Xianzhi2，*
（1. Key Laboratory of Agro-products Processing and Storage of Chongqing， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China； 2. Insitute of Sericulture and Systems Biology， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Objective: To study the separation and stability of antioxidant peptides produced by enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein with a commercial enzyme preparation. Methods: The antioxidant peptides derived from silkworm pupa protein were separated and purified by ultrafiltration. Their antioxidant activity was determined by colorimetry. Results: The antioxidant peptides with molecular weights of 200-3 000 D were obtained by ultrafiltration and their IC50for superoxide anion， hydroxyl， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate （DPPH） free radical were 18.85 mg/mL， 3.13 mg/mL，and 35.23 μg/mL， respectively. The DPPH free radical scavenging rate of the ant ioxidant peptides after treatment with both pepsin and trypsin for 4 h was increased from an initial level of 81.05% to 82.26%. The DPPH free radical scavenging rate of the antioxidant peptides at a concentration of 100 μg/mL was 98.02% and 11.80% after treatment at pH 4 and 8 for 1 h，and 87.11% after heat treatment at 95 ℃ for 1 h， respectively. The DPPH free radical scavenging rate at a concentration of 60 μg/mL was reduced from an initial level of 51.58% to 22.68% after 6 h of incubation in the presence of 1.0 mol/L NaCl. Conclusion: The 200-3 000 D antioxidant peptides generated by enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein were capable of effectively scavenging superoxide anion and DPPH free radical and had reducing power； their DPPH free radical scavenging activity in an acidic environment was higher than in an alkaline environment， and was effectively maintained by desalination but not significantly affected by digestive enzymes or temperature. Key words: enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein； antioxidant peptides； separation and purification； stability

TS218

A

1002-6630（2015）03-0035-06

10.7506/spkx1002-6630-201503007

2014-03-03

國家現代農業（蠶桑）產業技術體系建設專項（CARS-22-ZJ0503）

丁順杰（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：dsjfreedom1990@163.com

黃先智（1965—），男，副研究員，博士，研究方向為蠶桑多元化利用。E-mail：popo1166@126.com