藏靈菇乳中具有優良抗氧化活性乳酸菌的篩選鑒定

羅 章，陳歷水，陳歷俊，劉繼超，姜鐵民

（1.西藏大學農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.中糧營養健康研究院，品牌食品研發中心，北京 102209；3.北京三元食品股份有限公司科研中心，北京 100086）

藏靈菇乳中具有優良抗氧化活性乳酸菌的篩選鑒定

羅 章1，陳歷水2，陳歷俊3，劉繼超3，姜鐵民3

（1.西藏大學農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2.中糧營養健康研究院，品牌食品研發中心，北京 102209；3.北京三元食品股份有限公司科研中心，北京 100086）

為了得到具有抗氧化活性的乳酸菌，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和抑制脂質過氧化法對11 株來源于西藏藏靈菇乳的乳酸菌抗氧化活性進行測定，包括它們的完整細胞和無細胞提取物，發現HN05菌株有較好的抗氧化活性。根據菌株的表型、生理生化特征和基因型的特性，初步將HN05菌株鑒定為清酒乳桿菌清酒亞種（Lactobacillus sakei subsp. sakei）。

藏靈菇乳；抗氧化活性；乳酸菌；鑒定

有研究表明自由基是導致機體氧化損傷的原因，如癌癥、肺氣腫、肝硬化、動脈粥樣硬化和關節炎等都與氧化損傷有關。因此，清除體內多余的自由基直接關系到生物體的健康。雖然人類與其他生物體都具有抗氧化防御和修復系統，可以保護機體免遭氧化損傷，但這些系統不能完全有效地防止損害。所以，通過補充抗氧化劑或含有抗氧化劑的食品可以幫助人體減少氧化損傷［1-2］。有報道［3-4］發現有的乳酸菌及其相關制品可減少體內的自由基含量，具有抗氧化活性，可預防和抑制脂質過氧化和減少一些相關疾病的發生。

藏靈菇乳是西藏傳統發酵乳制品，這類飲品由于其獨特的保健效果，在民間廣為流傳，長期飲用能夠增強人體免疫力、補充維生素、延緩衰老、消除疲勞，特別適合胃病、腎病和肝膽病患者。其發酵劑開菲爾粒（Kefir grain）是一種由數種乳酸菌、酵母菌和醋酸菌共生而成的多菌種復合體，呈乳白色、膠質狀，外形酷似米粒，可在鮮乳中生長、分裂并將其特性傳給下一代以產生新粒，藏靈菇由于其經過在牛奶中培養，體積會增大很多，形狀如盛開的雪蓮，所以又稱之為“西藏雪蓮”［5］?；诓仂`菇乳獨特的營養價值和生理功能，目前，開發適應大規模產業化生產的藏靈菇發酵劑，已成為國內外研究的熱點，藏靈菇的菌相研究尤為重要。本課題組對藏靈菇乳中篩選得到的乳酸菌進行體外抗氧化實驗，并將篩選得到的具有較強抗氧化活性的菌株進行進一步鑒定，為菌株的后期應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌株、試劑與培養基

被測乳酸菌均為西藏農牧民家自然發酵藏靈菇中分離得到。標準菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG）ATCC 53103和對照菌株德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）均為實驗室保藏。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、亞油酸 美國Sigma公司；吐溫-20、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）及其他試劑均為國產分析純。

MRS液體/固體培養基 北京陸橋生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）用酶、核酸分離試劑、電泳相關試劑與材料 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2儀器與設備

BD150L型厭氧培養箱 德國Binder股份有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）有限公司；BX53型微生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝科技有限公司；PCR儀 日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1樣品預處理

對藏靈菇進行無菌采樣，經低溫冰盒運輸，取樣品25 g加入到225 g無菌PBS（pH 7.4，含0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽）置于均質儀中拍打均質5 min，然后經過標準系列稀釋，制備成不同稀釋度的樣品供微生物分離使用。

1.3.2菌株活化

取4 ℃冰箱中貯存的2 代菌株，以1%接種量接種于滅菌的MRS培養基中，置于37 ℃振蕩培養箱中培養12 h，獲得新鮮的第3代培養物用于實驗。

1.3.3乳酸菌的培養

所有菌株都接種于MRS（液體/固體）培養基中（牛肉膏3 g、酵母提取物5 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.64 g、K2HPO45.0 g、冰乙酸4.30 mL、MnSO40.17 g、蛋白胨7.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸銨2.0 g、胰蛋白胨7.0 g、L-半胱氨酸0.5 g，加蒸餾水定容至1 L，調節至pH 6.2～6.5）高壓滅菌（1.01 MPa，121 ℃）15 min后備用。

1.3.4無細胞培養物的制備

所有的菌株經過3 次傳代。培養液5 000 r/min離心20 min，收集菌體，用PBS洗滌3 次，重懸浮于PBS溶液中，調整菌數到108CFU/mL，冰水浴中超聲破碎25 min細胞后，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液得無細胞提取物。

1.3.5清除DPPH自由基能力的測定

對DPPH自由基清除能力的測定參照參考文獻［6］。

1.3.6抗脂質過氧化能力的測定

參照文獻［7］方法略加改動。0.5 mL樣品與0.5 mL的PBS溶液（0.02 mol/L，pH 7.4）、1 mL亞油酸的乳化液（18.8 mL水中添加1 mL亞油酸，0.2 mL吐溫-20）混合，然后加入0.2 mL 0.01% FeSO4和0.2 mL 20 mmol/L H2O2在37 ℃水浴中反應12 h。反應液加入0.2 mL的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），2 mL的硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA），0.2 mL 0.4%的二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT），在100℃反應30 min，冷卻后加入2.5 mL三氯甲烷抽提，離心收集上清液在532 nm波長處測吸光度（A）。實驗中以PBS作為對照，抗脂質過氧化率以下式計算得出。

1.3.7乳酸菌的形態學鑒定及生理生化鑒定

乳酸菌在MRS培養基上培養24 h后進行革蘭氏染色和形態學檢測。過氧化氫酶活性檢測及發酵葡萄糖產氣實驗按照凌代文等［8］的方法進行。選擇在5、10、40、45 ℃不同溫度條件下進行生長實驗，其中5 ℃和10 ℃條件下培養14 d；40 ℃和45 ℃條件下培養7 d，分別在pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5和8.0條件下培養7 d，觀察乳酸菌的生長狀況［9］。分別在質量分數為 3.0%和6.5%的NaCl溶液中觀察乳酸菌的耐鹽能力。接觸酶實驗、葡萄糖產氣實驗及糖發酵實驗等生理生化特征的分析參照有關文獻［10］。

1.3.8乳酸菌的16S rDNA鑒定和進化分析

將確定的乳酸菌分離物涂布在MRS平板上厭氧37 ℃培養72 h后，觀察菌落形態和細胞顯微形態，利用通用引物（27F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1525R：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’）擴增乳酸菌16S rDNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序結果在NCBI BLAST中的核酸庫進行比對，根據相似度及評分來判斷菌株種屬，并應用Cluxtal X和MEGA 5.0軟件采用鄰位相連法構建系統發育樹。

1.3.9生長曲線的測定

用待測菌株24 h的培養液，以3%的接種量接入MRS液體培養基中，于37 ℃培養箱中培養36 h，每隔2 h取一次樣品，放于4 ℃冰箱中，最后以培養基為空白，在620 nm波長處測定樣品的光密度（OD）值，同時測定pH值，并以培養時間為橫坐標，相對應的OD620nm和pH值為縱坐標分別繪制生長曲線［11］。

1.4數據分析

所有實驗數據均采用SPSS統計軟件（16.0版）分析，每組實驗重復3 次，數據結果以的方式表示。

2　結果與分析

2.1具有抗氧化活性乳酸菌的篩選

清除DPPH自由基活性及抑制脂質過氧化活性的測定是篩選具有抗氧化活性菌株常用的方法［12］。當DPPH自由基遇到提供質子的物質抗氧化劑時就會被清除，表現為吸光度的降低?；诖嗽?，抗氧化物質的抗氧化能力可以用其清除DPPH自由基的能力來表示。本實驗對11 株來源于藏靈菇乳中得到的乳酸菌和1 株標準菌株ATCC 53103（所有測試菌濃度均約為108CFU/mL）清除DPPH的能力進行了測定，結果如表1所示?？芍煌娜樗峋憩F出不同的清除活性，而且乳酸菌完整細胞的活性一般要比相對應的提取物的活性低，比如完整細胞的活性為1%～37%不等，而提取物的活性范圍則在4%～47%之間。其中活性最強的為菌株HN05，其次是菌株LS31，這2 株菌的活性顯著高于包括標準菌株ATCC 53103的其他菌株（P＜0.05）。

表1　乳酸菌的清除DPPH自由基活性Table1 DPPH radical scavenging activity of LAB isolates

表1　乳酸菌的清除DPPH自由基活性Table1 DPPH radical scavenging activity of LAB isolates

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表2同。

菌株號完整細胞無細胞提取物HN0536.72±0.68g46.78±0.55ghLZ1532.43±0.40g25.31±2.19dLS1012.38±1.32d40.03±3.25hLS1511.90±0.54d29.57±0.27dLS3113.09±1.65d42.73±0.55efLZ041.21±0.03a12.31±0.10bLZ559.03±0.43c38.65±0.36eGB616.26±1.54e27.85±0.54dGB111.15±0.04a16.98±0.51cGB164.28±0.05b8.63±0.65bGB221.36±0.05a4.25±0.52aATCC 5310328.01±0.12f40.46±1.65ef

由于不飽和脂肪酸（LH）在活性氧的引發下可以發生過氧化反應，在脂類過氧化過程中產生L·、LO·、LOO·等自由基與LOOH。其中LOOH可使I-釋放，生成共軛二烯、乙烷等氣體及丙二醛等中間產物，通過測定中間產物可以得到抑制過氧化反應的能力［13］。通過測定12 株不同乳酸菌在亞油酸氧化體系中抑制脂肪過氧化的能力，結果如表2所示。乳酸菌完整細胞活性為6.48%～59.38%，低于相應的無細胞提取物的活性（45.78%～72.43%），這一結果與報道過的長雙歧桿菌ATCC 15708和乳酸菌ATCC 4356及其他乳酸菌趨勢相同［14］。

Lee等［15］曾對4 株乳桿菌的總抗氧化能力和對活性氧的耐受性進行測定后發現L. casei KCTC 3260的完整細胞和無細胞提取物抑制亞油酸過氧化的能力很強，抑制率分別達到了46.2%和72.9%。Lin等［16］對11 株乳酸菌進行抑制脂質過氧化反應和清除活性氧自由基能力的研究發現5 株L. delbrueckii ssp. bulgaricus和6 株St. thermophilus都顯示了較好的抑制亞油酸過氧化的能力，所有菌株的無細胞提取物都具有清除自由基能力。進一步研究發現Lacidophilus ATCC 4356和B. longum ATCC 15708的完整細胞對亞油酸過氧化反應的抑制率分別為48%和28%，對DPPH自由基的清除率分別為52%和21%［17］，與本實驗結果相近。本實驗發現菌株HN05具有較強的清除DPPH自由基活性，而且抑制脂質過氧化活性也比較高，所以選擇該菌株進行下一步研究；菌株LS31雖然有較強的清除DPPH自由基的能力，抑制脂質過氧化的能力卻比較低，所以沒有將該菌株做進一步研究。

表2　乳酸菌的抑制脂質過氧化活性Table2 Inhibitory activity of LAB isolates on lipid peroxidation　%

2.2乳酸菌的鑒定

2.2.1乳酸菌的形態學與生理生化特征

經實驗檢測，HN05菌株為桿狀，革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、同型發酵乳酸菌，具有一般乳桿菌的特性。采用德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）為對照菌株進行研究，所分離到的革蘭氏陽性桿菌在硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、溶血實驗、聯苯胺實驗、H2S產生實驗以及運動性實驗均呈陰性，在10～45 ℃之間均能生長，在pH 4.5的環境中生長，其結果與對照菌株一致，鑒定為乳桿菌屬的細菌，結果見表3。

表3　菌株 HN05的具乳桿菌屬鑒定結果Table3 Identification of strain HN05 with Latbcillus

菌株HN05除具有乳桿菌屬的特征外，能分解多種單糖、雙糖和多糖，但不能發酵鼠李糖、木糖，也不利用麥芽糖、棉子糖，15 ℃能生長分解七葉苷，水解精氨酸，初步鑒定為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），結果見表4。

表4　菌株 HN05的具清酒乳桿菌鑒定結果Table4 Identification of strain HN05 with Lactobacillus sakei

2.2.2乳酸菌菌株16S rDNA序列測定及系統進化樹的構建

通過乳酸菌16S rDNA的特異性對HN05菌株進行鑒定。提取該菌的總DNA，在滅過菌的PCR管中加入Taq酶、ddH2O、模板、上游引物UNI-F和下游引物UNI-R。離心后放入PCR儀中對其16S rDNA序列進行PCR擴增，擴增后進行電泳檢測，如圖1所示，發現該菌株的序列在1 000 bp與2 000 bp之間，將所得部分序列送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到菌株HN05的16S rDNA序列為1 453 bp。將測得的序列以BLAST軟件在GenBank中進行相似性檢索，用DNAStar軟件分析，結果發現菌株HN05和序列號為NR_075032.1（一株來源于美國的Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K）的同源性達100%。將得到的序列同GenBank中16 株同源性高于98%的乳酸菌進行BLAST分析，構建系統發育樹，如圖2所示。結果顯示菌株HN05與Lactobacillus sakei親緣關系最近。由此初步確定這株菌為Lactobacillus sakei。

圖1　菌株HN05 16S rDNA PCR產物擴增圖Fig.1 Electrophorogram of 16S rDNA PCR products from strain HN05

圖2　HN05菌株 16S rDNA序列系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences of strain HN05

2.3乳酸菌的生長曲線

圖3　乳酸菌HN05的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain HN05

圖4　乳酸菌HN05的pH值變化Fig.4 The pH change of strain HN05

3　結 論

本研究對從西藏藏靈菇乳中篩選得到的11 株乳酸菌進行抗氧化實驗后，得到一株具有抗氧化活性的菌株HN05，通過對該菌株的形態分析、生理生化分析及16S rDNA序列的測定，結果顯示該菌株為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。該菌株的對數生長期為2～12 h，12 h的生長速率達到最快，然后進入穩定期，此后OD620nm值變化較小，但稍有增加的趨勢，pH值逐漸下降直到7 h之后，逐漸穩定。

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Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria with High Antioxidant Activity from Tibetan Kefir

LUO Zhang1， CHEN Lishui2， CHEN Lijun3， LIU Jichao3， JIANG Tiemin3
（1. College of Food Science， Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University， Linzhi 860000， China；2. Brand Food Center of R&D， COFCO Nutrition and Health Research Institute， Beijing 102209， China；3. R&D Center， Beijing Sanyuan Food Co. Ltd.， Beijing 100086， China）

This study aimed to obtain lactic acid bacteria （LAB） with high antioxidant activity. Intact cells and cell-free extracts of 11 LAB isolates from Tibetan Kefir were evaluated for antioxidant activities by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazl（DPPH） free radical scavenging and linoleic acid peroxidation inhibition assays. Strain HN05 possessing excellent antioxidant activity was screened. Based on its morphological， biochemical， physiological and genotypic characteristics， this strain was identified as Lactobacillus sakei subsp. sakei.

Tibetan Kefir； antioxidant activity； lactic acid bacteria； identification

TS252.1

A

1002-6630（2015）03-0109-05

10.7506/spkx1002-6630-201503021

2014-02-08

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100903）

羅章（1965—），男，副教授，博士，研究方向為畜產品加工及貯藏。E-mail：luozhang1759@sohu.com