高效毛細管電泳法對5 個產地苦蕎中黃酮類化合物的檢測

郭芳芳，馮 鋒，，*，白云峰，劉荔貞，陳澤忠，李 蓉，周 高

（1.山西大學化學化工學院，山西 太原 030006；2.大同大學化學與環境工程學院，山西 大同 037009）

高效毛細管電泳法對5 個產地苦蕎中黃酮類化合物的檢測

郭芳芳1，馮 鋒1，2，*，白云峰2，劉荔貞2，陳澤忠2，李 蓉2，周 高2

（1.山西大學化學化工學院，山西 太原 030006；2.大同大學化學與環境工程學院，山西 大同 037009）

采用高效毛細管電泳法，分別對5 個不同產地苦蕎中黃酮類化合物進行檢測。電泳條件：10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液，pH 9.3，檢測波長218 nm，分離電壓25 kV。在該條件下，表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類化合物在7 min內得到分離，線性范圍分別為0.03～0.54、0.05～0.97、0.03～0.63、0.04～0.90 mg/mL，相關系數為0.992 3～0.998 7，最低檢出限分別為5.33×10-6、1.80×10-5、2.51×10-5、1.24×10-5mg/mL（RSN=3），平均回收率在95.5%～104.7%之間，相對標準偏差不大于3.66%。結果表明：該方法準確可靠，可用于苦蕎中黃酮類化合物的檢測。

高效毛細管電泳；黃酮類化合物；苦蕎

苦蕎，又名韃靼蕎麥，為一年生蓼科類草本植物，是國際糧農組織公認的糧藥的同源食物之一，苦蕎中含有大量的化學活性物質，包括黃酮類化合物［1-2］、維生素［3］、蛋白質［4］等。相關研究表明苦蕎的大多數藥理作用都與苦蕎中酚類化合物有關，而苦蕎中最主要的酚類化合物是黃酮類物質［5］。許多研究表明黃酮類化合物具有抗氧化［6-8］、抗腫瘤［9］、抗敏［10］、抗菌抗病毒［11］、降血糖［12］、降血脂［10-12］、降血 壓等作用［13］。因此建立一種對苦蕎中的黃酮類化合物進行檢測的方法非常重要。

目前對苦蕎中黃酮類化合物的檢測方法主要有分光光度法［4，14-16］、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法［17］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［18-22］、液相色譜-質譜聯用技術［23］以及毛細管電泳法［24］等。分光光度法選擇性較差，TLC法測定結果準確度低，HPLC法試劑消耗量大，所需成本高、分析時間長。而毛細管電泳法具有試劑消耗量小、柱效高、分析速度快、經濟環保等優點，被廣泛運用于食品和藥品活性物質的檢測中。到目前為止，毛細管電泳技術對于不同產地苦蕎中黃酮類化合物的分析應用尚未有見報道。本實驗采用毛細管電泳法對5 個不同產地的苦蕎中表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類物質進行測定，為苦蕎的質量評價提供了科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

四川大涼山、山西廣靈、山東沂蒙、云南昆明、山西左云的苦蕎 市購；氫氧化鈉（分析純） 天津市化學試劑批發公司；硼砂、硼酸（均為分析純） 天津化學試劑三廠；黃酮類化合物（表兒茶素、蘆丁、山奈酚、槲皮素） 美國阿拉丁公司；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2儀器與設備

P/ACETMMDQ高效毛細管電泳儀（配有紫外檢測器以及32 Karat軟件） 美國Beckman公司；內徑75 μm未涂層石英毛細管 邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司；KQ5200DA型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AP250D分析天平 美國Ohaus公司；TDL-16B型離心機 上海安亭科學儀器廠；PSH-2C型精密酸度計 上海大普儀器有限公司；0.22 μm一次性針孔過濾器；Lambda35紫外-可見分光光度計 美國PerkinEimer公司。

1.3方法

1.3.1溶液配制

分別稱量10 mg表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素于4 個10 mL容量瓶中，用二次蒸餾水溶解后定容成1.0 mg/mL標準儲備液。配制10 mmol/L硼砂（Na2B4O7）溶液，用10 mmol/L硼酸（H3BO3）溶液調至pH值為9.3。

1.3.2樣品處理

采用超聲法［25］對苦蕎中黃酮類化合物進行測定。稱取適量苦蕎，在真空干燥器中烘干，后將其研成粉末，精密稱取5 g于50 mL錐形瓶中，加入20 mL體積分數75%甲醇溶液并封口，超聲提取30 min，超聲前后用體積分數75%乙醇溶液將不足量補足，轉移至離心管中，以6 000 r/min離心10 min，取上層清液，用0.22 μm一次性針孔過濾器過濾2 次，放置于冰箱中4 ℃保存備用。

1.3.3操作條件

對新毛細管進行活化，在20 psi條件下，用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液各沖洗30 min；2 次進樣間分別用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液沖洗5 min。檢測波長218 nm；分離電壓25 kV；進樣時間5 s；緩沖溶液：15 mmol/L Na2B4O7-H3BO3，pH 9.3。

2　結果與分析

2.1電泳分離條件的確定

2.1.1檢測波長的選擇

用甲醇配制一定質量濃度的表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素的標準溶液，用甲醇做空白，在波長200～450 nm范圍內對其進行紫外掃描，確定5 種色素在波長218 nm處均有較大吸收，故將218 nm作為最佳檢測波長。

2.1.2緩沖溶液濃度和pH值的選擇

考察了Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液在不同濃度（10、20、30、40、50 mmol/L）時，4 種黃酮類化合物的分離情況。隨著緩沖溶液濃度增大，電流不斷增大，同時產生較多焦耳熱，基線響應信號值增加，4 種黃酮類化合物不能完全出峰。綜合考慮，本實驗選擇10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3為最佳緩沖溶液濃度。

考察pH值分別在9.1、9.2、9.3、9.4時對4 種黃酮類化合物分離的影響，結果如圖1所示。當pH值為9.1時，表兒茶素和蘆丁未能完全分離；隨著pH值的增大，4 種分析物分離度變大，pH值為9.3時，分離完全；當pH值為9.4時，蘆丁和山奈酚兩峰部分重合，分離不完全，因此實驗中選擇9.3為最佳pH值。

圖1　pH值對分析物分離的影響Fig.1 Effect of running buffer pH on the separation of four analytes

2.1.3分離電壓和進樣時間的選擇

提高分離電壓，可以縮短分析時間，提高分離效率，但電壓過高，體系產生的焦耳熱也隨之增加，有可能出現基線不穩，進而影響分離效果。考察15、20、25、30 kV時，4 種黃酮類化合物的分離情況，結果如圖2所示。分離電壓在15 kV時，分析時間長，山奈酚和槲皮素峰形差；分離電壓為20 kV和25 kV時，化合物可以完全分離，但在分離電壓為25 kV條件下，分析時間短；分離電壓為30 kV時，表兒茶素和蘆丁兩峰分離不是很完全。綜合考慮，選擇25 kV作為最佳分離電壓。

圖2　分離電壓對分析物分離的影響Fig.2 Effect of applied voltage on the separation of four analytes

在最佳電泳條件下，考察進樣時間為3、4、5、6、7 s時4 種黃酮類化合物的的分離情況，結果如圖3所示。進樣時間小于5 s時，進樣量少，峰面積較小，但是當進樣時間大于5 s時，峰面積增大，峰形展寬，峰形變差。綜合考慮，選擇5 s作為最佳進樣時間。

圖3　進樣時間對分析物分離的影響Fig.3 Effect of injection time on the separation of four analytes

2.2標準曲線及檢出限測定結果

用甲醇做溶劑，配制4 種黃酮化合物的系列標準溶液（0.03～0.97 mg/mL），在最佳電泳條件下進行測定，以峰面積對質量濃度作圖，得出各組分的線性方程、線性相關系數、線性范圍和各物質的檢出限（RSN=3），結果如表1所示。

表1　4 種黃酮化合物的線性方程及檢出限Table 1 Standard curves for determining four fl avonoids by HPCE and their limits of detection

2.3精密度實驗結果

通過考察4 種黃酮類物質遷移時間以及峰面積的日內、日間相對標準偏差（relation standard deviation，RSD），對方法的精密度進行評估。4 種標樣各取50 mL混合均勻，在最優電泳條件下日內、日間連續進樣3 次，根據所得數據計算4 種黃酮類物質遷移時間和峰面積的RSD，結果見表2。日內精密度RSD不大于1.88%，日間精密度RSD不大于3.66%，表明該方法精密度良好。

表2　精密度實驗Table 2 Results of precision experiments

2.4實際樣品的測定

圖4　實際樣品的測定Fig.4 Chromatograms of real samples

按照1.3.2節方法對苦蕎樣品進行處理，在最佳電泳條件下對樣品進行分析，采用標準加入法來確定樣品中是否含有被檢測的黃酮類物質，結果如圖4所示。在實際樣品中分別添加一種黃酮標準樣品后，只有相對應的電泳峰明顯升高且沒有引起新的電泳峰出現，證明實際樣品中有4 種被測黃酮類化合物的存在。

表3　5 種樣品的分析結果（n=3）Table 3 Assay results for flfl avonoids in fifi ve samples （n= 3）

按照1.3.2節的方法對苦蕎樣品進行處理，提取液經微孔膜過濾2 次后連續進樣3 次，對數據進行處理，結果如表3所示。不同產地的苦蕎中，4 種被測黃酮類化合物中蘆丁含量均為最高。其中四川大涼山苦蕎中山奈酚和槲皮素含量均高于其他產地苦蕎。山西廣靈苦蕎中表兒茶素含量最高。被測4 種黃酮化合物總量從大到小分別為四川大涼山＞山西廣靈＞山東沂蒙＞云南昆明＞山西左云。

2.5回收率實驗結果

在最佳電泳條件下進行回收率實驗，通過向苦蕎樣品提取液中加入一定量（3 個水平）的黃酮類化合物，來測定回收率，結果如表4所示，回收率范圍在95.5%～104.7%之間，RSD在1.57%～4.48%之間，表明該方法準確可靠。

表4　回收率實驗Table 4 Results of recovery experiments

3　結 論

本實驗使用高效毛細管電泳法，對5 個不同產地苦蕎中黃酮類化合物進行測定，在最佳電泳條件下（檢測波長218 nm，分離電壓25 kV，15 mmol/L Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液，pH 9.3），表兒茶素、蘆丁、山奈酚和槲皮素4 種黃酮類化合物在7 min內得到分離，線性范圍分別為0.03～0.54、0.05～0.97、0.03～0.63、0.04～0.90 mg/mL，相關系數為0.992 3～0.998 7，最低檢出限（RSN=3）分別為5.33×10-6、1.80×10-5、2.51×10-5、1.24×10-5mg/mL，平均回收率為95.5%～104.7%，RSD不大于3.66%。實驗結果表明該方法準確可靠，適用于苦蕎中黃酮類化合物的分析。

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Determination of Flavonoids in Buckwheat from Five Different Growing Areas by High Performance Capillary Electrophoresis

GUO Fangfang1， FENG Feng1，2，*， BAI Yunfeng2， LIU Lizhen2， CHEN Zezhong2， LI Rong2， ZHOU Gao2
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2. College of Chemical and Environmental Engineering， Datong University， Datong 037009， China）

An effi cient high performance capillary electrophoresis （CE） method has been successfully developed for the determination of flavonoids in buckwheat. The running buffer contained 10 mmol/L Na2B4O7-NaH2PO4， at pH 9.3， the detection wavelength was set at 218 nm and a voltage of 25 kV was applied. Under these conditions， four fl avonoids， i.e.，picatechin， rutin， kaempferd and quercetin， could be fully separated from each other within seven minutes. The linear ranges were 0.03 to 0.54， 0.05 to 0.97， 0.03 to 0.63， and 0.04 to 0.90 mg/mL， respectively， with correlation coeffi cients between 0.992 3 and 0.998 7 and the limits of detection （LOD） were 5.33 × 10-6， 1.80 × 10-5， 2.51 × 10-5， and 1.24 × 10-5mg/mL，respectively （RSN= 3）. The average recoveries were between 95.5% and 104.7%， with a relative standard deviation （RSD）less than 3.66%. This method is convenient to operate， accurate， effi cient and suitable for the simultaneous detection of fl avonoids in buckwheat.

high performance capillary electrophoresis； fl avonoids； buckwheat

O611.5

A

1002-6630（2015）18-0085-04

10.7506/spkx1002-6630-201518015

2015-01-25

國家自然科學基金面上項目（21375083）

郭芳芳（1989—），女，碩士研究生，主要從事毛細管電泳研究。E-mail：13546046121@163.com

馮鋒（1964—），男，教授，博士，主要從事光分析化學研究。E-mail：feng-feng64@263.net