臍帶間充質干細胞輔助游離脂肪的移植研究

顧偉，羅旋，匡勇△

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200021；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海 200001)

1 引 言

由于創傷、手術切除、先天畸形等原因導致的軟組織缺損，采用組織移植以改善或恢復生理功能或外形是最重要的治療手段。自體脂肪組織其生物相容性好，質地、外形自然而不存在免疫排斥反應，是軟組織缺損修復的最理想材料。但脂肪移植術后往往在長期觀察中出現脂肪細胞成活率低，移植物組織被吸收等問題。2007年Yoshimura[1]等報導了將脂肪干細胞與脂肪共同移植進行軟組織填充，有效提高了成活率，并將這一技術命名為細胞輔助的脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL)。其不足之處是，需要消耗更多的脂肪組織，以獲得脂肪組織中的各種細胞(主要是脂肪間充質干細胞，血管內皮前體細胞和內皮細胞等)。而需要脂肪移植的患者，常不能提供足夠的優質脂肪量。另外，脂肪細胞作為成體細胞隨著患者年齡的增加其增殖分化能力不斷下降[2]。為此，我們設計應用來源更加廣泛，且無創的臍帶間充質細胞來替代脂肪間充質細胞，對比研究脂肪干細胞和臍帶間充質干細胞在輔助游離脂肪移植中的異同。

2 實驗材料及方法

2.1 實驗材料

本實驗所涉及的臍帶均來自上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院婦產科，由無任何基礎疾病產婦提供，4名，25～34歲；脂肪組織來自上海交通大學仁濟醫院整形外科，由無任何基礎疾病吸脂求美者提供，6名，27～43歲。所有提供者均知情同意。

本實驗所用裸鼠均來自上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院動物實驗室，4周齡，雌性。

2.2 實驗方法

我們設計應用臍帶間充質干細胞與脂肪組織顆粒混合后，移植到裸鼠皮下，與單純脂肪組織移植作對照，不同的時間觀察其在改善組織缺損和轉歸及作用機制的異同。

取傳至第3代的臍帶間充質干細胞(1x106)制成80 ul稀薄懸液，與脂肪顆粒(0.5ml)混合為實驗組，80 ul培養液與脂肪顆粒(0.5 ml)混合為對照組，在相同條件下移植于裸鼠皮下，經一周，一個月，兩個月時間，取出移植物，觀察大體吸收情況，測量移植物重量，血管生成情況，real-time PCR實驗檢測VEGF、PPAR-γ基因表達情況。

2.3 數據統計

本實驗所有數據均采用統計軟件SPSS17.0對其進行t檢驗分析，P<0.05為有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 動物實驗結果

移植第一周后，兩組間移植物的大小和重量沒有明顯改變。1個月時，兩組移植物較1周時縮小，提示有部分被吸收，2個月時，兩組移植物均明顯被吸收(見圖1A)。三個觀測時間點重量的差異沒有顯著的統計學意義(見圖1B)。

表1 臍帶間充質干細胞輔助游離脂肪移植各組移植物重量(單位：g)

圖1 移植物的大體觀及重量

可見1周時兩組移植物未見明顯吸收，大體及重量相近；一個月時，臍帶間充質干細胞組移植物重量略高，2個月時，對照組幾乎全部吸收，臍帶間充質干細胞組也有大部分被吸收，僅有少量存留。

Fig1Grossappearanceoftransplantatedtissues

There is no obvious change both in control and UCMSCs groups at 1week after transplantation. At 1month and 2months post-transplantation, UCMSCs supplemented grafts are a bit bigger than control group,and the weight are a little higher.

各組移植物取下后立即固定、包埋、切片、HE染色，觀察組織內細胞成活及血管生成情況。見圖2。

3.2 Real-time PCR分析

移植物中的VEGF、PPAR-γ基因表達水平通過real-time PCR技術進行檢測，結果見圖3。

圖2 移植物組織切片的HE染色兩組移植物脂肪組織改變差異不明顯。物鏡10倍放大。

圖3 移植物中PPAR-γ、VEGF基因表達水平

三個觀測時間點中，兩組間PPAR-γ表達相同，而臍帶間充質干細胞組VEGF表達較高。

Fig3Real-timePCRanalysisofthePPAR-γ，VEGFgeneexpression

The UCMSCs group have higher VEGF gene expression, while no difference between the two groups about PPAR-γexpression

各組移植物中的PPAR-γ基因表達顯示，移植后1周，對照組與臍帶間充質干細胞成脂轉錄因子PPAR-γ的表達基本相同，移植后1個月、2個月兩組PPAR-γ基因表達也未見顯著改變，兩組間PPAR-γ基因表達水平之間差異無統計學意義(見圖3A)。移植后1周，對照組與臍帶間充質干細胞組VEGF基因表達水平均較低，無顯著差異；在1個月和2個月時，兩組VEGF表達維持在較低水平，無顯著的改變，對照組與臍帶間充質干細胞組差異無統計學意義(見圖3B)。

4 討論

臍帶間充質干細胞是一種原始的間充質干細胞，可以在體外條件下穩定傳代和凍存復蘇，而不發生自發分化，且可以保持較強的增殖能力[3]。體外經化學試劑和生長因子作用后，可以分化為軟骨、骨和脂肪等中胚層來源的細胞，而且可以轉分化為神經元、膠質細胞和內皮細胞等外胚層來源的細胞[4-5]。大部分成體干細胞的增殖分化活力會隨著年齡增長而衰退[6]，但臍帶間充質干細胞不存在上述問題，而仍然能夠保持較強的增殖分化能力[7]。同時，臍帶間充質干細胞能夠分泌抑制細胞凋亡的生長因子，具有免疫豁免和免疫調節的特性，無同種異體免疫排斥反應，且儲量豐富，獲取方便，體外培養擴增穩定，是臨床應用中一種較為理想的干細胞[8]。

本實驗以單純的脂肪移植作為對照，將臍帶間充質干細胞和脂肪混合后作為實驗組進行研究，結果表明，在移植后第一周，兩組移植物均未表現出明顯的吸收；1個月，臍帶間充質干細胞組的移植物略高于單純脂肪對照組；2個月的長期觀察中，兩組移植物均有較大程度的吸收，臍帶間充質干細胞組移植物重量仍略高于對照組，然而所有觀察時間點兩組間差異沒有統計學意義。進一步將兩組移植物內血管生長因子VEGF和成脂轉錄因子PPAR-γ的基因表達進行研究，發現臍帶間充質干細胞并不能顯著提高移植物中VEGF及PPAR-γ的表達，雖然文獻[5]提到臍帶間充質干細胞能夠分泌多種神經營養因子、干細胞因子等，然而，我們的研究結果表明，臍帶間充質干細胞對于特定的細胞因子VEGF及轉錄因子PPAR-γ基因表達沒有促進作用，提示臍帶間充質干細胞不能像脂肪干細胞一樣促進移植物的血管新生和成脂分化。

移植物中脂肪細胞成活的數量和單個細胞的脂肪含量決定著移植物的體積。其內部所含的干細胞成脂分化能力也會對移植物的體積產生影響。有研究證實，臍帶間充質干細胞在成脂分化方面的速度要慢于脂肪干細胞，在同等誘導條件下，臍帶間充質干細胞需要較長時間才能夠出現脂肪細胞的形態改變以及完成向成脂細胞的轉變過程[9]。上述實驗結果的原因有可能是由于干細胞本身的組織特異性所致：來源于某一組織的干細胞會一定程度的保留原有組織的特性，某些決定其向原組織細胞分化的基因在誘導之前就已經處于預激活狀態。脂肪干細胞是脂肪組織內具備增殖和分化能力的干細胞，承擔著脂肪組織內成熟脂肪細胞更新的來源，能夠高效的分化為成熟脂肪細胞，本就有較高的成脂分化傾向，其基因組中成脂分化轉錄因子PPAR-γ表達較其他組織來源干細胞處于較高水平。本實驗中的臍帶間充質干細胞并不能夠促進移植物中PPAR-γ基因表達的明顯增高，而來源于脂肪組織的脂肪干細胞則能夠很好的提高移植物中相關成脂基因PPAR-γ的表達，說明在干細胞輔助脂肪移植中，其組織來源影響了這些細胞在移植后作用的發揮。這可能是導致本實驗結果移植物重量沒有統計學差異的原因之一。

綜上，臍帶間充質干細胞不能夠有效提高移植物重量、成脂以及血管生成的修復效應，其作為脂肪干細胞的替代，用于游離脂肪移植的效果尚不成熟。