右歸丸鼠血清恢復凍融小鼠卵巢的功能

李啟佳，　陸 華*，　鄧延莉

（1.成都中醫藥大學第二附屬醫院，四川　成都　610041；2.成都中醫藥大學，四川　成都　610075）

右歸丸鼠血清恢復凍融小鼠卵巢的功能

李啟佳1，陸 華1*，鄧延莉2

（1.成都中醫藥大學第二附屬醫院，四川成都610041；2.成都中醫藥大學，四川成都610075）

目的 探討右歸丸（熟地黃，附子，肉桂，山藥，吳茱萸，菟絲子，鹿角膠，枸杞子，當歸，鹽杜仲）鼠血清對程序化凍融小鼠卵巢組織功能的影響。方法 40只6周齡ICR小鼠經孕馬血清促性腺激素刺激，其卵巢經液氮中凍存2 d后復蘇，將所有卵巢組織隨機分為空白組、空白血清組、尿促卵泡素組及右歸丸血清組。所有卵巢經特殊DMEM高糖培養基培養24 h后從左側卵巢中取出未成熟卵母細胞，微滴法培養24 h觀察并計算小鼠卵細胞體外第一極體（PB1）排出率。并通過酶聯免疫吸附法檢測培養基中雌二醇（E2）水平，右側卵巢組織中小鼠成熟促進因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）水平。結果 卵巢組織凍融后，右歸丸血清組的卵母細胞成熟率、卵巢組織中的MPF、FSH-R和LH-R的水平高于尿促卵泡素陽性組和空白組。右歸丸血清組體外培養基中E2水平較空白血清組高，并顯著高于空白組。結論 右歸丸有可能在臨床上成為一種輔助凍存卵巢組織功能恢復有效的補腎中藥復方。

程序化凍融；小鼠卵巢組織；右歸丸；含藥血清

祖國醫學認為“腎藏精”、“腎主生殖”，腎與女性生殖功能關系密切。補腎中藥和方劑對女性生殖功能的調控在臨床上有明顯的作用。據文獻報道，臨床上補腎中藥有促進卵泡成熟、增加卵泡數量和改善卵巢儲備功能的作用［1-6］。近年實驗室研究發現，含補腎中藥鼠血清加入卵細胞體外培養基中，可促進小鼠未成熟卵細胞生長發育，主要是促進卵細胞核成熟，并且不增加成熟卵細胞細胞骨架的異常率［7］。并發現其作用機制與增強卵細胞成熟促進因子調節亞基Cyc1in B1的表達有關。

在臨床治療中，為保持接受化療、放療或對性腺實施手術患者的生育能力，需進行卵母細胞、胚胎或卵巢組織的冷凍儲存。但是成熟卵細胞對溫度變化敏感以及修復細胞內損傷的能力較低，且在冰晶的形成過程中會導致紡垂體損傷或減數分裂期出現異常，因此，臨床很少采用卵子冷凍。胚胎的冷凍效果相對較好，但所需時間較長，會耽誤患者的治療，且只適用于那些已經結婚或同意接受供精的患者，不適于青春前期的兒童，因而對癌癥患者的臨床應用也有一定局限性。而將卵巢組織冷凍是將數百個不成熟卵泡保存起來，既不需要卵巢刺激，也不會耽誤癌癥治療，因而在保存婦女生育能力方面具有較大潛力［8］。

但是，卵巢組織經冷凍后再復蘇過程必定對生殖細胞的功能有一定損壞［9］。如上所述，補腎中藥無論在體內還是體外對生殖細胞功能均有促進作用。那么，補腎中藥能否幫助冷凍卵巢組織功能恢復呢？因此，本研究旨在探索右歸丸鼠血清是否能夠在小鼠卵巢組織凍融后的體外培養階段對卵巢功能有影響。

1　材料

1.1實驗動物及飼養環境 清潔級ICR雌性小鼠40只，分批次購于成都達碩實驗動物有限公司，5周齡，體質量21～24 g，許可證號：SCXK（川2008-24）。二級實驗室，常規條件（清潔無塵，空氣新鮮，溫度18～22℃，相對濕度50%～60%，噪音85 dB以下，氨質量濃度20mg/L。通風換氣8～12次/h）適應性飼養一周。

1.2試劑 孕馬血清購于寧波第二激素廠；注射用尿促性素（HMG）和注射用尿促卵泡素（FSH）購于麗珠集團麗珠制藥廠；DMEM高糖培養基、RPMI 1640培養基、透明質酸酶和礦物油購于美國Sigma公司；人輸卵管液（HTF）、HEPES緩沖液、卵裂液（C1eavage）和蛋白代用品（SPS）購于美國Quinn's公司；胎牛血清（FBS）和雙抗購于美國Gibco公司；小鼠雌二醇（E2）、MPF、FSH-R、LH-R及肌動蛋白ELISA試劑盒、大鼠FSH、LH、雌二醇（E2）及孕酮（P）ELISA試劑盒均購于Cusabio華美生物；甲醇為色譜純購于Honeywe11 Burdick&Jackson公司；磷酸為色譜純購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.3儀器 3111型細胞培養箱（Thermo公司）；CK40型倒置顯微鏡（O1ympus公司）；體視顯微鏡（O1ympus公司）；Mu1tiscan spectrum酶標儀（Thermo公司）；A11egra 64R型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mi11i-Q純水儀（美國Mi11ipore公司）；AB 265-5型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；島津LC2010C液相色譜系統柱溫箱、紫外檢測器、四元低壓梯度輸液泵、真空脫氣機、系統控制器、SPD-M10Avp二極管陣列檢測器、Shimadzu反相C18色譜柱組成（日本島津公司）。

1.4右歸丸鼠血清的制備

1.4.1血清樣品前處理方法 用蛋白沉淀法進行血漿樣品前處理，即取血漿150μL，加入高氯酸-甲醇液（15μL 50%高氯酸+5μL甲醇），漩渦振蕩2 min，再20 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試液待檢。

1.4.2分離空白血漿樣品及含藥血漿樣品條件

Shimadzu反相C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm），流動相A為MeOH，流動相B為0.1% H3PO4水溶液（0～28 min，10%→70%A；28～38 min，70%→100%A）；體積流量1.0 mL/min，溫度30℃，檢測波長259 nm，進樣量70μL。

1.4.3右歸丸鼠血清的制備 取體質量220～250 g的SD大鼠［清潔級，6～8周齡，許可證號：SCXK（川）2004-15。飼養于清潔級動物室，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～70%，10 h/14 h明暗交替，每3 min自動換氣1次，常規全價顆粒飼料喂養，自由飲水，雌雄分開飼養于不銹鋼飼養籠內］，雌雄兼用，隨機分為兩組，即正常對照組、右歸丸組。試驗前禁食不禁水16 h，各給藥組分別一次性給予右歸丸復方（5.0 g/kg），給藥劑量為20 mL/kg，正常對照組給予等劑量的蒸餾水。分別于給藥后30、60、90 min眼底靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min，分離各給藥組各時間點血清即得。

1.5自行配制的培養液和凍存液

1.5.1組織洗液 FBS20%（V/V）+RPMI 1640培養基，主要用于去掉卵巢組織表面多余的脂肪組織。需實驗當天提前1 h配制，并預熱至37℃。

1.5.2PBI培養基、平衡液、復蘇液和DAP 213凍存液 配方均參考Fujio等［9］文獻中提到的Whittingham［10］的配方。

1.5.3卵巢組織體外培養基 DMEM高糖培養基（含有NaHCO3，L-半胱氨酸，0.25 mo1/L HEPES），雙抗（青霉素+鏈霉素）1%（V/V），FBS10%（V/V），HMG 100 IU/L。空白血清組在基本培養基中加入3%（V/V）空白鼠血清，FSH組在基本培養基中加入0.3 IU/mL FSH，右歸丸血清組在基本培養基中加入3%（V/V）右歸丸鼠血清。卵巢組織復蘇當天，提前1 h將卵巢組織體外培養基預熱至37℃。

2　方法

2.1小鼠分組 將40只ICR雌性小鼠隨機分為4組，10只為一組，分別為空白組、空白血清組、FSH組及右歸丸血清組。

2.2小鼠卵巢組織的凍存 雌鼠處死前48 h，均腹腔注射孕馬血清1 mL（500 U/mL）促排卵。鑷子、解剖剪、眼科鑷、眼科剪常規酒精消毒準備。促排后44～48 h將雌鼠斷頸處死，酒精消毒下腹部，剪開皮膚及腹膜，迅速用眼科鑷鈍性分離出子宮及雙側卵巢，并用眼科剪剪下雙側卵巢組織。將剪下的左右兩側卵巢組織分別放入對應側的組織洗液（預熱至37℃）中，體視鏡下鈍性分離卵巢表面多余的脂肪組織和結締組織。將處理后的兩側卵巢組織分別放入對應側的卵巢體外培養基（預熱至37℃）中收集。每3～4個卵巢組織放入對應側的緩沖液（4℃）中預處理5 min，并剪成約1 mm×2 mm×2 mm的組織塊。預處理后的卵巢組織放入對應側的凍存管中，每個凍存管中放入一個卵巢的組織塊，并加入60μL緩沖液，4℃下靜置15 min。再向每個凍存管中加入DAP 213凍存液120μL，每個凍存管再在0℃冰水中靜置30 min。然后將凍存管放入程序降溫盒（-1℃/min）中，置于-80℃冰箱中過夜。第2天將凍存管放入液氮罐中凍存2 d。

2.3小鼠卵巢組織的復蘇 將凍存管從液氮罐中取出，在室溫中放置30 s，然后向凍存管中加入900μL復蘇液（預熱至37℃）稀釋，用1 mL移液管吸出凍存液及復蘇液，再用眼科鑷輕輕將卵巢組織夾至含有PBI培養基（預熱至37℃）的60 mm皿中洗滌，最后放入體外培養基中（48孔板培養1 d，每孔400μL體外培養基，每孔一個卵巢）培養24 h。

2.4取卵 將體外培養24 h后的左側卵巢組織轉移至含有PBS（預熱至37℃）的35 mm皿中洗滌，然后迅速移至HEPES微滴中（預熱至37℃，35 mm皿，每個皿4個HEPES微滴并蓋礦物油）。右側卵巢組織不作處理，待用。

用1 mL空針挑破卵巢組織，體視鏡下找出卵母細胞，用制好的無菌巴氏管將卵細胞轉移至含有HTF微滴的35 mm皿中（提前4 h配制并預熱至37℃，上面蓋礦物油），15 min取一個卵巢。迅速將35 mm皿放入CO2培養箱（37℃，5%CO2，飽和濕度）中培養24 h。

2.5觀察卵母細胞體外成熟情況 從培養箱中取出35 mm培養皿，放在熱臺上，通過倒置顯微鏡進行觀察。如卵細胞外面有顆粒細胞包繞，用制好的無菌巴氏管反復吹打，去掉顆粒細胞后再觀察，并記錄各個微滴卵細胞成熟數。以卵細胞排出第一極體（PB1）作為成熟的指標，成熟率=PB1個數/總卵細胞數。

2.6測定E2及大鼠血清激素成分 將各個卵巢組織的體外培養基吸出，用小鼠E2的ELISA試劑盒測定培養基中的E2水平。

將同批次右歸丸鼠血清樣本、空白鼠血清樣本各取出6個，用大鼠FSH、LH、E2、P的ELISA試劑盒分別進行鼠血清中FSH、LH、E2、P水平的測定。

2.7肌動蛋白（Actin）、成熟促進因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）的測定 將右側卵巢組織取出，每只卵巢組織加入500μL蛋白裂解液勻漿并離心，取上清液進行成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體和肌動蛋白（Actin）的檢測。肌動蛋白作為內參，成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的濃度值均與肌動蛋白濃度值進行比較，所得數據分別為成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體水平的相對值，將上述相對值進行統計分析。

各組數據均在SPSS 19.0軟件包下進行統計分析。均數比較采用T檢驗，率的比較采用單因素方差分析和T檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

3　結果

3.1各組卵細胞體外成熟率的比較 小鼠卵巢組織經程序化冷凍復蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和鼠右歸丸含藥血清處理24 h，分離出未成熟的卵細胞用微滴法比較卵細胞成熟的情況，即第一極體（BP1）出現率。空白對照組、空白血清組、FSH組和右歸丸鼠血清組的PB1出現率見表1。右歸丸鼠血清組第一極體（PB1）出現率與其余3組相比，P＜0.05，0.01，0.01和0.01。代表圖像見圖1。

3.2各組培養基中E2的比較 小鼠卵巢組織經程序化冷凍復蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和鼠右歸丸含藥血清處理24 h。然后測定培養液中E2的量。空白對照組、空白血清組、FSH組和右歸丸鼠血清組體外培養液中E2質量濃度分別為（339.5±11.8）pg/mL、（456±4.03）pg/mL、（486.05±8.95）pg/mL和（507.9±7.58）pg/mL（圖2）。右歸丸鼠血清組較空白血清組高（P＜0.05），并顯著高于空白組（P＜0.01）。FSH組和空白血清組體外培養基中E2水平均顯著高于空白組（P＜0.01）。見圖2。

表1　各組卵細胞體外成熟率的比較（±s）Tab.1 Com parison of the in vitro maturation rate of oocytes（±s）

表1　各組卵細胞體外成熟率的比較（±s）Tab.1 Com parison of the in vitro maturation rate of oocytes（±s）

注：各組數據one-way variation分析，F=4.107，P=0.032。各組數據兩兩比較，采用T檢驗：與FSH組比較，▲P＜0.05；與空白血清組比較，※P＜0.05

分組卵細胞數PB1數PB1出現率/% 135 10 7.47±5.00空白血清組200 13 6.15±3.49 FSH組238 16 5.80±6.27右歸丸鼠血清組156 19 12.35±3.60空白對照組▲※

圖1　各組卵細胞第一極體出現的代表性圖片Fig.1　Pictures of oocytes w ith the first poIar body

圖2　各組培養基中E2水平Fig.2　Concentration of estradioIin themedium

3.3 各組小鼠卵巢組織肌動蛋白（Actin）、成熟促進因子（MPF）、卵泡刺激素受體（FSH-R）及黃體生成激素受體（LH-R）的比較 小鼠卵巢組織經程序化冷凍復蘇后分別采用空白鼠血清、FSH和右歸丸鼠血清處理24 h，然后測定卵巢組織中肌動蛋白、成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體水平。結果見表2。右歸丸鼠血清組的卵巢組織中的成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的水平高于FSH組和空白組。

3.4空白鼠血清和右歸丸鼠血清中卵泡刺激素、黃體生成激素、雌二醇及孕酮的水平 均采用ELISA法測定。表3顯示，空白鼠血清中FSH水平最高，右歸丸鼠血清中FSH水平與FSH組中水平相當。空白鼠血清中LH水平較右歸丸鼠血清中LH水平高。空白鼠血清組培養基中原始E2和P水平較右歸丸鼠血清組培養基中原始E2水平略低。

表2　各組小鼠卵巢組織肌動蛋白、成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的比較（±s）Tab.2 Comparison of reIative concentration of Actin，MPF，FSH-R and LH-R in m ice ovary tissue（±s）

表2　各組小鼠卵巢組織肌動蛋白、成熟促進因子、卵泡刺激素受體及黃體生成激素受體的比較（±s）Tab.2 Comparison of reIative concentration of Actin，MPF，FSH-R and LH-R in m ice ovary tissue（±s）

注：與FSH組比較，▲P＜0.01；與空白對照組比較，※P＜0.01；與空白對照組比較，★P＜0.05；與空白血清組比較，＊P＜0.05

分組動物數/只肌動蛋白/（μmo1·mL-1）成熟促進因子/（pg·mL-1）卵泡刺激素受體/（U·L-1）黃體生成激素受體/（pg·mL-1）空白對照組10 1.30±0.06 48.70±0.61 2.85±0.04 202.35±4.26空白血清組10 2.10±0.17▲76.50±4.46▲※4.55±0.26▲※236.35±7.46▲FSH組10 4.50±0.04 50.45±1.49 2.75±0.06 197.35±5.20右歸丸鼠血清組10 2.40±0.38※★83.50±1.82▲※4.20±0.22▲※294.65±6.8★※＊

表3　鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、雌二醇（E2）及孕酮（P）的水平（±s）Tab.3 Concentration of LH，FSH，E and P in rat serum（±s）

表3　鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、雌二醇（E2）及孕酮（P）的水平（±s）Tab.3 Concentration of LH，FSH，E and P in rat serum（±s）

注：各組數據兩兩比較，采用兩個獨立樣本T檢驗，▲P＜0.01，※P＜0.01，★P＜0.05

血清樣本數/個FSH/（IU·L-1）LH/（ng·L-1）E2/（ng·L-1）P/（μg·L-1）空白鼠血清6 5.29±0.87 13.52±2.10▲22.10±1.18※3.74±0.54★右歸丸鼠血清6 4.07±4.12 1.56±0.07 9.57±0.89 5.08±1.13

4　討論

在凍存過程中，卵巢組織中的各級卵母細胞均停留在凍存前的發育階段，復蘇之后，無論體外培養還是植入體內，均需要卵巢組織能最大限度的恢復功能，卵母細胞能夠重新啟動發育過程，并最終形成具有生殖功能的成熟卵母細胞，達到保留生育能力的目的。因此在卵巢組織復蘇后對卵巢功能的干預非常有必要。由于體外培養只能模擬體內的條件，有研究發現在合理的體外條件下，小鼠卵巢內的卵泡有繼續發育的趨勢，培養2 d之內的酶活性與正常的相比無明顯差異，因此對卵巢組織凍融后的體外干預時間應在2 d之內［17］。細胞凍存時，隨著溫度的降低，細胞內的許多酶和受體的活性均會降低，在凍存階段干預藥物影響不大。若在凍存前使用藥物進行卵巢功能的干預，所需周期較長，并且對于非性腺腫瘤進行放化療而需要保留生育能力的患者，并不需要在卵巢組織凍存之前進行藥物干預，因此凍存前使用藥物進行卵巢功能的干預，臨床應用不是必須的。因此本研究將藥物干預時間選擇在復蘇后，并且只干預24 h。

MPF是一種蛋白激酶，在細胞從G2期進入到M期時起著重要作用。MPF的活躍能促進卵母細胞進入減數分裂。形態上，卵母細胞生發泡的破裂，跟破裂前幾小時MPF的活性增強有關。G2/M時，MPF被激活，促進G2/M的轉變，可見，MPF在卵母細胞成熟過程中起著非常重要的作用，MPF的激活啟動了減數分裂［18］。

實驗結果顯示，小鼠卵巢組織凍融后，其中MPF的表達水平，右歸丸鼠血清組和空白血清組明顯高于FSH組和空白組。雖然右歸丸鼠血清組與空白鼠血清組之間對比無統計學意義，但前者MPF的表達水平比后者高，且更穩定（空白血清組標準差為4.46，右歸丸血清組標準差為1.82）。由此推測，右歸丸鼠血清可能通過增加卵巢組織中MPF的表達水平，促進卵母細胞減數分裂，進而促進凍融后體外培養過程中卵母細胞的成熟。

顆粒細胞（Granu1osa Ce11）是卵泡刺激素（Fo11ic1e-Stimu1ating Hormone，FSH）作用于卵巢的靶細胞［19］。在FSH的作用下，竇狀卵泡的顆粒細胞獲得黃體生成激素（Luteinizing Hormone，LH）受體。

雌激素（Estradio1，E2）的合成是由卵巢的卵泡膜細胞與顆粒細胞在FSH和LH的協同作用下完成的。卵泡膜細胞上的LH-R與LH結合后可使細胞內膽固醇形成雌激素的前身物質睪酮和雄烯二酮并進入顆粒細胞。顆粒細胞上的FSH-R與FSH與結合后可激活芳香化酶活性，將睪酮和雄烯二酮轉化為雌二醇和雌酮。

實驗結果顯示，培養基中E2水平，右歸丸鼠血清組較空白血清組高，并顯著高于空白組，FSH組和空白血清組顯著高于空白組；小鼠卵巢組織中FSH-R的表達水平，右歸丸鼠血清組和空白血清組明顯高于FSH組和空白組。LH-R的表達水平，右歸丸血清組明顯高于FSH組和空白組，同時也高于空白血清組，而空白血清組高于空白組。由于FSH組與右歸丸鼠血清組培養基中FSH的水平基本相當，故培養基中FSH的原始水平對實驗結果無必然影響。

由此推測，右歸丸鼠血清組雌激素（E2）水平較其他幾個實驗組更高，可能與FSH-R和LH-R的表達水平明顯提高有關，而FSH-R和LH-R的表達水平提高可以促進卵母細胞的成熟。至于右歸丸鼠血清是否能提高凍融后卵巢組織睪酮（T）的水平，進而通過這一途徑提高培養基中E2水平尚需進一步研究證實。

在小鼠卵巢組織玻璃化凍存過程中，全程添加FSH更有利于卵巢組織形態結構的保持［20］。在小鼠卵巢自體移植時添加FSH可提前恢復卵巢組織血供［21］。

本實驗結果表明，雖然4次實驗中FSH組取到的卵細胞數量最多，但是成熟率最低，且右歸丸鼠血清組的卵母細胞成熟率明顯高于該組。因此，我們認為右歸丸鼠血清在本研究中對程序化凍融后的小鼠卵母細胞體外成熟的影響作用強于FSH。

目前已知，竇狀卵泡期的顆粒細胞在FSH的持續作用下獲得黃體生成激素（Luteinizing Hormone，LH）受體。那么可以推測，卵巢組織中FSH-R的表達水平提高后，對FSH的結合能力提高，FSH對竇狀卵泡的顆粒細胞的作用能力提高，從而提高LH-R的表達水平。

此外，本研究結果還提示，LH-R的表達水平，右歸丸鼠血清組明顯高于FSH組和空白組，同時也高于空白血清組，空白血清組LH-R的表達水平高于空白組。

但在FSH-R表達水平的檢測結果中，右歸丸鼠血清組較空白血清組低，根據FSH-R和LH-R檢測數據的結果分析，推測：（1）空白血清能提高卵泡中FSH-R的表達水平，從而間接提高LH-R的水平；（2）右歸丸鼠血清，除了具有空白血清的相同成分以外，還含有右歸丸成分，在產生與空白血清相似的作用以外，還有可能直接提高LH-R的表達水平；（3）空白血清對FSH-R的表達水平作用強于右歸丸鼠血清，而右歸丸鼠血清對LH-R的表達水平作用強于空白血清。

對右歸丸鼠血清和空白血清中FSH、LH、E2和P水平的檢測提示，FSH和LH的水平，空白血清均顯著高于右歸丸鼠血清，但LH-R的表達水平，右歸丸鼠血清組高于空白血清組，而FSH-R的表達水平卻表現為右歸丸鼠血清組較空白血清組低，進一步證實了鼠血清中右歸丸的成分對LH-R表達的作用強于其對FSH-R表達的作用。

中醫理論認為，“腎藏精，主生殖”，《素問·上古天真論》（本文《素問》原文均引自《重廣補注黃帝內經素問》，北京：中醫古籍出版社，2003年）曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長，二七天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子”。“天癸”相當于現代醫學中各種與生殖相關的激素，而腎是天癸之源。卵子屬生殖之精的范疇，女性生殖系統的調節是以腎-天癸-沖任-胞宮生殖軸的功能及其相互間的平衡協調為前提。卵子發育、成熟的過程中，腎精的充盛與否與卵泡是否能發育成熟密切相關，腎陽的推動作用，能促進卵泡的發育、成熟。對女性而言，腎中陽氣失于推動作用，卵泡的發育、成熟均會受到影響。從而導致不孕。

對于腎陽不足而致不孕的患者，補腎助陽是臨床常用的治療手段。補腎助陽的經典方劑之一“右歸丸”，出自明代著名醫家張景岳的《景岳全書·新方八陣》［11］。其功效為溫補腎陽，填精益髓。主治腎陽不足，命門火衰證。中醫婦科臨床應用很廣泛，有報道右歸丸對腎陽虛型的不孕、滑胎、月經后期等癥，只要辨證準確，均有較好療效［12-13］。

前期對補腎中藥的實驗研究發現，含補腎中藥鼠血清加入卵細胞體外培養基中，可促進小鼠未成熟卵細胞生長發育，主要是促進卵細胞核成熟，并且不增加成熟卵細胞細胞骨架的異常幾率［8］。臨床上，在體外受精-胚胎移植過程中，采用滋腎或溫腎中藥進行調理，能改善卵巢儲備功能，從而使體外受精-胚胎移植女性患者能募集到足夠數量的卵子［2］。補腎方藥可以顯著改善卵細胞成熟度［14］、增加患者的獲卵數［3-4］、提高優質卵率［5-6］。表明補腎中藥有促進卵泡成熟、增加卵泡數量和改善卵巢儲備功能的作用。

右歸丸作為溫補腎陽的經典方，現代醫學、藥理學進行了多項研究。徐曉娟［15］等運用體外培養技術進行小鼠卵巢顆粒細胞體外培養，將右歸丸水提液直接加入培養基，發現右歸丸水提液高劑量組（0.18 g/mL）可明顯增加顆粒細胞雌激素、孕酮分泌量，同時顯著增加顆粒細胞內cAMP的水平。方云蕓［16］等通過建立雄激素致排卵障礙型不孕大鼠模型，第80日齡開始給藥，5周后股動脈取血，用放免法檢測血中E2和T水平。發現右歸丸能夠增加血清中E2水平、降低血清中T的水平。因此推測右歸丸有可能通過促進T轉化為E2這一途徑，達到促排卵和助孕安胎的功效。

在本課題中，凍存的小鼠卵巢組織均被置于-196℃的液氮中，極低的外界溫度滿足寒邪生成的條件，在凍存過程中，小鼠卵巢組織功能停滯，相當于中醫理論中寒邪所致的機體機能下降。而卵巢組織復蘇后，在卵巢組織體外培養基中加入具有溫腎助陽功效的右歸丸鼠血清，結果表明其能明顯促進凍融后小鼠卵巢組織功能的恢復。也從另一個方面為溫陽促進生殖提供了實驗依據，同時說明右歸丸在體內、體外均對生殖有促進作用。

但右歸丸鼠血清促進凍融后小鼠卵巢組織功能恢復的更深入的機制，還需后續研究。

［1］劉偉信，黃 萍，羅孟軍，等.卵巢組織的冷凍和移植研究進展［J］.國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊，2003，23（5）：525-527.

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Rats'serum containing Yougui PiIIs regains frozen-thawed mouse ovarian function

LIQi-jia1， LU Hua1*， DENG Yan-1i2
（1.The Second Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610041，China；2.The Clinical School of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China）

AIM To exp1ore the effects of rat serum containing Yougui Pi11s（Rehmanniae Radix praeparata，Aconiti lateralis Radix praeparata，Cinnamomi Cortex，Cinnamomi Cortex，Evodiae Fructus，Cuscutae Semen，Cervi Cornus Colla，Lycii Fructus，Angelicae sinensis Radix，Eucommiae Cortex）on the function of programmed frozen-thaw ofmouse ovarian tissue in vitro.METHODS Ovarieswere co11ected from 40 6-week-o1d ICR mice，which were stimu1ated by pregnantmare serum gonadotropin.A11ovarian tissue were cryopreserved in 1iquid nitrogen and recovered after two days.Then，the ovarieswere random1y assigned into four groups：b1ank group，b1ank serum group，fo11ic1e-stimu1ating hormone（FSH）group and Yougui Pi11s serum group.A11ovarieswere cu1tivated in specia1DMEM medium for24 hours，and immature oocyteswere removed from the 1eft-side ovaries.Fina11y，the exc1usion rates of the first po1ar body of oocytesweremeasured under amicroscope and an inverted microscope.E2（estradio1）1eve1s of themedium were assayed by an ELISA.At the same time，contents ofMPF，FSH-R and LHR of ovarian tissues in the right sidewere determined by ELISAs.RESULTS The oocytesmaturation rate and the 1eve1s of MPF，FSH-R and LH-R in the Yougui Pi11s serum group were significant1y higher than those in the FSH group and b1ank group.E21eve1s of cu1turemedium in the Yougui Pi11s serum group were higher than those of the b1ank serum group and b1ank group.CONCLUSION The present resu1ts suggest that Yougui Pi11smay be an effective formu1a to assist the function recovery of frozen-thawed ovaries in c1inica1practice.

programmed frozen-thaw；mouse ovary tissue；Yougui Pi11s；serum contained drugs

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0021-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.005

2014-01-15

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2010CB530403）；國家自然科學基金（81173288）；四川省科技廳青年基金（2010JQ0038）

李啟佳（1986—），女，碩士生，醫師，從事中醫藥對女性生殖調控的研究。E-mai1：1qj_1etty@126.com

陸 華（1964—），女，博士，研究員，從事中醫藥對女性生殖調控的研究。E-mai1：kjc1h@126.com