益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠PPARγ與DLK1的影響

陳文龍，　曹文富，　李 強，　高世嬌，　何 英

（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶　400016）

益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠PPARγ與DLK1的影響

陳文龍，曹文富*，李 強，高世嬌，何 英

（重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶400016）

目的 觀察益氣化瘀化痰養陰方（黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲）對肝纖維化大鼠肝組織超微結構及過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）與De1ta樣蛋白1（DLK1）表達的影響。方法 110只雄性大鼠，正常組10只，余100只大鼠采用“皮下注射CC14+高脂低蛋白飼料+酒精飲料”誘導肝纖維化大鼠模型，成模后再隨機分為肝纖維化模型組、秋水仙堿治療組、益氣化瘀化痰養陰方低、中及高劑量組。正常組和模型組灌服生理鹽水。采用光鏡觀察肝組織結構，電鏡觀察肝組織及細胞超微結構，RT-PCR法檢測大鼠肝組織PPARγmRNA水平，Western b1ot法檢測各組大鼠肝組織PPARγ與DLK1蛋白表達水平。結果 益氣化瘀化痰養陰方中、高劑量組及秋水仙堿組肝組織內纖維化程度有不同程度減輕，肝組織PPARγmRNA水平和蛋白表達水平明顯增加，DLK1大分子蛋白表達水平顯著降低。結論 中、高劑量益氣化瘀化痰養陰方可抑制大鼠肝組織纖維化，其作用機理可能與增加肝組織內PPARγ的表達，抑制DLK1大分子表達有關。

益氣化瘀化痰養陰方；肝纖維化；肝組織結構；過氧化物酶體增殖物激活受體；De1ta樣蛋白1；大鼠

肝纖維化（1iver fibrosis）是各種原因引起的慢性肝臟損傷共同的組織病理學變化，是影響慢性肝病預后的重要環節。臨床發現，氣陰兩虛、痰瘀阻絡是肝纖維化非常常見的兩種病證分型［1-2］，臨床觀察和前期研究也發現，益氣化瘀化痰養陰方煎劑可以降低肝組織內纖維化程度［3］。動物及細胞研究發現，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、De1ta樣蛋白1（DLK1）與肝纖維化的發生、發展密切相關［4-5］。本研究旨在觀察PPARγ與DLK1在肝纖維化大鼠肝組織內的表達特征，并在既往研究的基礎上，進一步研究益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織PPARγ、DLK1表達的影響，探討益氣化瘀化痰養陰方抗纖維化可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1主藥藥物、試劑與儀器 本實驗所需中藥飲片均購自重慶桐君閣股份有限公司，秋水仙堿由云南植物藥業公司生產；PPARγ一抗、二抗均購自于北京中杉公司，Western b1ot相關試劑均購自碧云天生物技術研究所，Trizo1總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、擴增試劑均由Takara公司生產，普通PCR儀、凝膠成像儀為BIO-RAD公司，紫外分光光度儀為Beckman公司，H-7500型電鏡為日本日立公司生產。

1.2中藥制備 精選黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲（藥物比例2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2），混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養陰方煎劑，低劑量、中劑量及高劑量煎劑，每1 mL分別含生藥1、2、4 g。

1.3肝纖維化造模方法 參考文獻［6］，大鼠皮下注射40%（V/V）CC14橄欖油溶液，首劑量為5 mL/kg體質量，以后每隔3日改為3 mL/kg體質量，持續4周。造模開始前2周給予高脂、低蛋白質復合飼料（豬油20%+膽固醇0.5%+玉米粉79.5%），2周后改用普通飼料，6周造模期間用10%白酒作為唯一飲料。

1.4動物分組與給藥 雄性SD大鼠110只，體質量（200±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（許可證號：【SYXK（渝）2007-0001】），飼養于重慶醫科大學SPF級動物實驗室。動物在適應性喂養1周后，隨機選取10只作為正常對照組，給予正常飲食、飲水，余100只大鼠按照參考文獻方法［6］制備肝纖維化模型，造模結束后共87只存活，隨機取2只大鼠行肝組織HE染色光鏡觀察其是否成模。結果顯示，所取大鼠肝組織切片檢查均符合肝纖維化特征。將剩余的85只大鼠隨機分為肝纖維化模型組、秋水仙堿治療組、益氣化瘀化痰養陰低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組17只。益氣化瘀化痰養陰方低、中、高劑量組分別給予相應劑量中藥煎劑（劑量分別為10、20、40 g/kg），秋水仙堿組給予秋水仙堿水溶液灌胃（劑量0.1 mg/kg）；正常對照組及肝纖維化模型組灌服等量的生理鹽水。12周后處死大鼠。

1.5檢測指標與方法 最后一次用藥后24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，于冰盒上處死大鼠，摘取肝臟，取部分肝組織分別用10%福爾馬林固定和4%戊二醛固定，待做HE染色、Masson染色及電鏡檢查，其余標本置-196℃液氮中冷凍后再轉移到-70℃冰箱中保存。

1.5.1光鏡觀察 肝組織用10%福爾馬林固定，常規脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟后行HE及Masson染色，在光鏡下觀察肝組織病理形態學變化。Masson染色照片采用Image-Pro P1us 6.0圖像分析軟件進行半定量分析，每張切片隨機選取3個視野（×400倍），測定藍色膠原總面積，取平均值，計算其占視野總面積的百分比。

1.5.2電鏡觀察 活體大鼠麻醉后取下1 mm3肝組織，立即放入4℃4%戊二醛溶液中固定2 h，0.1 mo1/L PBS液清洗，1%四氧化鋨溶液固定，常規乙醇和丙酮梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋、固化，制備0.5μm厚度的半薄切片，在光鏡下定位后再制備60 nm厚度超薄切片，再經醋酸鈾-枸椽酸鉛雙染色，H-7500型透射電鏡觀察肝組織及細胞超微結構。

1.5.3RT-PCR法檢測肝組織PPARγmRNA表達

根據試劑說明書，提取大鼠肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度和純度，分別根據PPARγ與內參GAPDH基因編碼序列，設計其特異性擴增引物（表1），由Takara公司合成。采用RT-PCR三步法，以上述總RNA為模板，42℃20 min條件下逆轉錄為cDNA。PCR反應條件預變性94℃3 min，94℃30 s，53.8℃30 s，72℃45 s，共30個循環，于72℃延伸5 min，4℃保存。反應結束后取PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并將凝膠置于凝膠成像儀上用Quantityone 4.6圖像分析軟件進行照相分析。各條帶的相對光密度值=目的條帶光密度值/內參GAPDH條帶光密度值。

表1　PPARγ與內參基因引物序列、退火溫度及產物大小Tab.1 Primer sequences and reaction conditions

1.5.4Western-b1ot法檢測肝組織PPARγ與DLK1蛋白表達 稱取一定量的肝臟組織，加入10倍體積的組織裂解液勻漿，超聲破碎細胞，冰浴30 min后，4℃12 000 r/min離心30 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經15%SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBST洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，顯影，進行灰度分析。

1.6統計學處理 所有數據采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，計量資料用±s表示，對符合參數檢驗要求的數據進行單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。以P＜0.05確定為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠一般情況 實驗過程中，造模成活率87%，治療過程中僅正常組大鼠無死亡，各組大鼠存活率無明顯差異。正常組大鼠體質量平穩增加，行動自如，反應敏捷，毛發密集有光澤，糞便干燥；模型組大鼠瘦弱，腹部略顯飽滿，活動明顯減少，反應遲鈍，食欲差，排稀便，毛色暗淡，皮毛稀松、易脫落，部分大鼠毛發打結，耳部與尾部蒼白、發涼，其余各治療組均較模型組有不同程度好轉。

2.2不同劑量益氣化瘀化痰養陰法中藥對肝組織病理形態的影響

2.2.1肉眼觀察 正常組大鼠肝臟顏色紅潤，形態正常，包膜完整，表面光滑平整，質地柔軟，與周圍組織無粘連，切面光滑。模型組與中藥低劑量組顏色紫暗，部分可見灰白色條紋，表面粗糙有顆粒感，切面油膩，有砂粒感，部分與大網膜粘連。秋水仙堿組肝臟顏色較正常組偏暗，部分與大網膜粘連，中藥中劑量與高劑量組肝臟外觀接近正常肝臟。

2.2.2HE染色光鏡觀察 正常組大鼠肝小葉結構完整、清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞呈多邊形，無變性、壞死，有1～2個圓形細胞核，核仁明顯，核內染色質稀疏，染色較淺，胞漿豐富；模型組可見肝小葉結構紊亂，肝細胞內大量大小不等空泡，胞漿稀疏，細胞核被擠壓到細胞邊緣，并可見大量炎性細胞浸潤，且以匯管區最為明顯；秋水仙堿組可見不完全的纖維間隔，肝細胞內空泡較模型組明顯減少，可見少量炎性細胞浸潤；益氣化瘀化痰養陰方中、高劑量組肝組織未見假小葉形成，肝細胞形態基本正常，僅于匯管區有少量炎性細胞浸潤；而益氣化瘀化痰養陰方低劑量組與模型組形態較接近。HE染色結果見圖1。

2.2.3Masson染色光鏡觀察 由圖2可見，正常組僅有少量膠原表達于中央靜脈壁及匯管區。模型組可見大量膠原纖維沉積于匯管區，并沿匯管區向外延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉。與模型組相比，中藥中、高劑量組及秋水仙堿組的肝小葉結構基本恢復正常，肝索排列較整齊，膠原沉積明顯減少，纖維間隔變薄，而中藥中劑量組肝組織形態與模型組較接近，但膠原纖維較模型組有所減少。Masson圖像分析（表2）也證實，益氣化瘀化痰養陰法中藥能顯著降低大鼠肝組織膠原纖維的水平（P＜0.01）。

表2　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織膠原纖維表達（±s）Tab.2 Effects of YHHY on expression Iiver coIIagen percentage of rats with Iiver fibrosis（±s）

表2　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織膠原纖維表達（±s）Tab.2 Effects of YHHY on expression Iiver coIIagen percentage of rats with Iiver fibrosis（±s）

組別代號標本數量膠原纖維/%正常組Ⅰ10 6.63±1.14df模型組Ⅱ11 31.22±2.92bf秋水仙堿組Ⅲ15 13.12±1.24bd中藥低劑量組Ⅳ13 24.33±3.19bdf中藥中劑量組Ⅴ15 10.88±0.96bdf中藥高劑量組Ⅵ16 7.08±1.54df

2.2.4電鏡觀察 正常組肝細胞形態正常，細胞間緊密連接，內質網、線粒體及核蛋白體豐富，毛細膽管微絨毛豐富，形態正常；模型組及中藥低劑量組可見肝細胞萎縮，細胞表面絨毛減少，以纖維間隔周圍最為明顯，其內大量脂滴，細胞核基本正常，線粒體、內質網等細胞器腫脹且數量明顯減少，線粒體嵴稀少甚至消失，糖原稀疏，并可見較多成纖維細胞及少量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞浸潤，周圍可見大量纖維沉積，膽小管擴張；秋水仙堿組可見部分肝細胞核固縮，部分線粒體稍腫脹；中藥中劑量及高劑量組可見少量線粒體輕微腫脹，未見明顯炎性細胞浸潤及纖維增生，余形態與正常組較接近。結果見圖3。

圖1　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織病理形態的影響（HE染色，10×40倍）Fig.1　Effects of YHHY on Iiver histopathoIogy in ratsw ith Iiver fibrosis（HE staining，×400）

圖2　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織膠原水平變化的影響（M asson染色，10×40倍）Fig.2　Effects of YHHY on Iiver coIIagen secretion in rats w ith Iiver fibrosis（M asson staining，×400）

2.3益氣化瘀化痰養陰方對肝組織PPARγmRNA與蛋白表達的影響 肝組織PPARγmRNA（見圖4A）與蛋白表達（見圖4B）。由表3可見，益氣化瘀化痰養陰方中、高劑量組及秋水仙堿組可明顯增加大鼠肝組織細胞中PPARγmRNA與蛋白表達水平，與模型組比較均具有顯著差異（P＜0.05），益氣化瘀化痰養陰方法中、高劑量組與秋水仙堿組比較有非常顯著性差異（P＜0.01），而益氣化瘀化痰養陰方低劑量組PPARγmRNA及蛋白表達水平與模型組相比，差異無統計學意義（P=0.99，P=0.50）。

圖3　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織細胞超微結構的影響Fig.3　Effects of YHHY on u Itrastructure of Iiver tissue and ceIIs in ratsw ith Iiver fibrosis（TEM）

圖4　益氣化瘀化痰養陰方對大鼠肝組織PPARγm RNA與蛋白表達的影響Fig.4　Effects of YHHY on mRNA and protein expression of PPARγ

2.4益氣化瘀化痰養陰方對肝組織DLK1蛋白表達的影響 由圖5可見Western b1ot檢測到兩種DLK1蛋白（DLK1大分子蛋白DLK1-L和DLK1小分子蛋白DLK1-S）。正常組幾乎不表達DLK1蛋白。DLK1-S在其余各組表達無明顯差異（F= 1.179，P=0.328）；而DLK1-L在肝纖維化模型組中明顯高于其余各組（與中藥低劑量組相比P= 0.031，與其余各組相比P＜0.01）。見表3。

圖5　益氣化瘀化痰養陰方對大鼠肝組織DLK1蛋白表達的影響Fig.5　Effects of YHHY on protein expression of DLK 1

3　討論

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）屬于激素核受體超家族，參與脂肪形成，細胞的生長、分化及其他生物過程。研究表明，PPARγ與肝纖維化密切相關。PPARγ參與了肝星狀細胞（HSC）活化的TGF-β、腫瘤壞死因子α（TNFα）、血小板源性生長因子（PDGF）、瘦素等多個信號轉導通路［7-8］，與細胞因子共同調控HSC的增殖及ECM的生成［9］。DLK1是表皮生長因子（EGF）家族的成員之一，又稱為脂肪前體細胞因子1（preadipocyte factor 1，Pref-1），是脂肪細胞分化的抑制因子，它能抑制脂質累積以及PPARγ等各種脂肪細胞轉錄因子的表達［10］。最新試驗表明，PPARγ與DLK1都在肝纖維化過程中具有重要意義，且二者有著密切的內在聯系，DLK1可通過Wnt信號通路及其下游信號通路，抑制PPARγ表達并使HSC活化［11-12］，從而促使肝纖維化形成。

表3　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織PPARγ與DLK 1表達的影響（±s）Tab.3 Effects of YHHY on expression of PPARγand DLK1 in rats w ith Iiver fibrosis（±s）

表3　益氣化瘀化痰養陰方對肝纖維化大鼠肝組織PPARγ與DLK 1表達的影響（±s）Tab.3 Effects of YHHY on expression of PPARγand DLK1 in rats w ith Iiver fibrosis（±s）

注：與正常組相比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組相比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與秋水仙堿組相比較，eP＜0.05，fP＜0.01

組別PPARγ PPARγmRNA/GAPDH PPARγ/β -actin正常組0.59±0.10de0.55±0.10bdf0.00±0.00df0.00±0.00 -actin DLK1 DLK1-S/β-actin DLK1-L/β bdf模型組0.42±0.08bf0.28±0.09bf0.17±0.04b0.39±0.07bdf秋水仙堿組0.52±0.06ad0.43±0.09bdf0.19±0.02b0.26±0.07bdf中藥低劑量組0.42±0.07bf0.31±0.06f0.19±0.01b0.33±0.11bcf中藥中劑量組0.66±0.06adf0.53±0.10df0.18±0.03b0.18±0.04bdf中藥高劑量組0.67±0.07adf0.54±0.10df0.18±0.03b0.19±0.07bdf

在本實驗中，模型組大鼠PPARγmRNA量和蛋白水平明顯降低，而DLK1大分子表達明顯增加。其可能的機制是肝臟受到慢性損傷時，肝細胞中DLK1顯著表達，導致HSC活化，可能通過經典Wnt信號通路，抑制PPARγmRNA和蛋白表達，從而導致ECM大量堆積，形成肝纖維化。可以認為，PPARγ參與了HSC靜止表型的維持，可減輕DLK1的致纖維化作用，可能是治療肝纖維化的一個靶點。

益氣化瘀化痰養陰方治療肝纖維化，選用黃芪、白術益氣健脾、利濕，是臨床上最常用的益氣藥對之一；川芎、姜黃共湊活血祛瘀、行氣開郁之效；半夏、海藻燥濕化痰，消痞軟堅散結，為化痰要藥；白芍養血斂陰，柔肝止痛，配鱉甲滋陰潛陽，軟堅散結，又能增強滋養肝陰之效。現代研究表明，上述中藥或其有效成分具有抗肝纖維化作用，如黃芪能抑制肝星狀細胞（hepatic ste11ate ce11，HSC）活化增殖、促進細胞凋亡、抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達［13］。川芎嗪、姜黃素能抗脂質過氧化，可通過抑制TGF-β1/Smads、瘦素等信號轉導通路，抑制HSC的增殖和活化，從而發揮其抗肝纖維化的作用［14-15］。白芍總苷能抑制NF-κB和TGF-β1蛋白表達，抑制HSC分泌透明質酸和Ⅲ型前膠原［16-17］。鱉甲提取物可降低Ⅲ型和Ⅵ型膠原而發揮抗肝纖維化作用［18］。

本實驗研究顯示，益氣化瘀化痰養陰方可改善肝纖維化大鼠肝組織病理損害程度，中、高劑量益氣化瘀化痰養陰方可提高大鼠肝組織內PPARγ mRNA和蛋白水平，并抑制DLK1大分子蛋白表達。

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Effect of Yiqi Huayu Huatan Yangyin Formu Ia on expression of PPARγand DLK 1 in rats with Iiver fibrosis

CHENWen-1ong， CAOWen-fu*， LIQiang， GAO Shi-jiao， HE Ying
（Department of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

AIM To eva1uate the anti-fibrotic effect of Yiqi Huayu Huatan Yangyin Formu1a（YHHY）（Astragali Radix，Atractylodismacrocephalae Rhizoma，Chuanxiong Rhizoma，Curcumae longae Rhizoma，Pinelliae Rhizoma，Sargassum，Paeoniae Radix alba，TrionycisCarapax）consisting of four genera1methods of“benefiting qi，removing b1ood stasis，expe11ing ph1egm，and nourish yin”on the expression of peroxisome pro1iferator-activated receptorγ（PPARγ）and de1ta-1ike 1 homo1ogue（DLK1）in ratswith 1iver fibrosis.METHODS One hundred ma1e ratswere injected 40%（V/V）carbon tetrach1oride disso1ved in o1ive hypodermica11y and fed with 1owprotein and high-fat diet to induce 1iver fibrosismode1.The survived rats aftermode1ingwere random1y divided into 1iver fibrosismode1group，co1chicine group，1ow-，moderate-and high-dose YHHY group.The other ten ratswere recruited as norma1contro1group.Rats in norma1 contro1group and themode1group were given sa1ine by gavage. After the corresponding treatment，1iver tissue histo1ogica1examination was carried out to examine the 1iver patho1ogy.PPARγmRNA 1eve1wasmeasured by RT-PCR.The protein expression of PPARγand DLK1 were assessed by Western-b1ot.RESULTS Data from moderate-and high-dose of YHHY group and co1chicine group presented the decrease in 1iver fibrosis to different degrees.PPARγmRNA and protein expression increased whi1e DLk1 proteins decreased in these groups.CONCLUSION Themoderate-and high-dose YHHY Formu1a can intervene the 1iverfibrosis.Theirmechanism may be re1ated to the increase of 1iver expressions of PPARγand the inhibition of DLK1.

YiqiHuayu Huatan Yangyin Formu1a（YHHY）；1iver fibrosis；1iver structure；peroxisome pro1iferator-activated receptorγ（PPARγ）；de1ta-1ike 1 homo1ogue（DLK1）；rat

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0028-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.006

2014-01-06

國家自然科學基金預研項目（NSFYY-201108）

陳文龍（1984—），男，碩士生，從事中醫藥防治器官纖維化研究。Te1：15102314386，E-mai1：niker1ong@163.com

曹文富（1962—），男，醫學博士，主任醫師，碩士生導師，從事中西醫結合內分泌代謝病與腎病基礎與臨床研究，器官纖維化與衰老的基礎與干預研究，中藥新藥開發研究。Te1：13883658367，E-mai1：caowenfu9316@163.com