秦皮甲素通過抑制Ras/ERK通路誘導人肺癌細胞A549凋亡

王 晶

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121000）

秦皮甲素通過抑制Ras/ERK通路誘導人肺癌細胞A549凋亡

王 晶

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

目的 探討秦皮甲素通過抑制Ras/ERK通路誘導人肺癌細胞A549凋亡的作用。方法 MTT法檢測肺癌細胞A549的增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，分光光度法檢測半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性，免疫印跡法檢測K-Ras、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表達的變化。結果秦皮甲素可抑制人肺癌細胞A549的增殖，IC50值為0.4 mmo1/L，并誘導凋亡；caspase3和caspase9表達增強，caspase8表達無明顯改變。p-ERK1/2和K-Ras蛋白表達減弱，而ERK1/2蛋白表達無明顯變化。結論 秦皮甲素通過顯著抑制K-Ras的表達和ERK1/2的磷酸化水平誘導人肺癌細胞A549凋亡。

秦皮甲素；人肺癌細胞A549；Ras/ERK通路；凋亡

秦皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，秦皮甲素是中藥秦皮中發(fā)揮藥理作用的主要有效成分［1］，現(xiàn)在中藥有效成分的臨床應用已經(jīng)成為中醫(yī)藥發(fā)展的重要內(nèi)容。秦皮藥材資源豐富，價格低廉，秦皮甲素是中藥秦皮中含有量最高的成分（1.436%～3.043%）。前期的研究顯示，秦皮甲素可以誘導人肺癌細胞H-125的凋亡［2］，但是對其具體作用機制并未進行深入探討；而且秦皮甲素對人肺癌細胞A549的作用并未進行研究。因此本實驗擬研究秦皮甲素對人肺癌細胞A549增殖、凋亡的作用并對其具體作用機制進行深入探討，為秦皮甲素的臨床應用提供理論依據(jù)與實驗基礎。

1　實驗材料

1.1細胞株 人肺癌細胞A549購于中國醫(yī)科大學。

1.2藥物 秦皮甲素（中國食品藥品檢定研究院，批號110740-200104）。兔抗人K-Ras、ERK1/ 2、p-ERK1/2一抗（Ce11Signa1ing公司），鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術公司）。

1.3試劑 MTT（Sigma公司）；Annexin-PI凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物有限公司）；caspase-3，caspase-8，caspase-9活性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；胰蛋白酶（Hyc1one公司）；小牛血清（杭州四季清生物制品公司）；RPML-1640培養(yǎng)基（南京凱基公司）。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4儀器 熒光顯微鏡（LEICACTR4000，德國），XD-101型倒置顯微鏡（OLYMPUS TOKYO JAPAN）；流式細胞儀（BD FACSCaLibur）；凝膠成像儀（美國BIORAD）；超凈工作臺（江蘇吳縣市凈化技術研究所）；二氧化碳培養(yǎng)箱（She1don Manufacturing IncUSA）；酶標儀（9602A北京普朗）。

2　實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每兩天換液1次，待細胞長至對數(shù)生長期時進行試驗。

2.2MTT法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期肺癌細胞，用0.25%胰酶消化，計數(shù)，以5× 103～10×103個/孔接種于96孔板中。待細胞貼壁生長后，將細胞分為陰性對照組、陽性對照組（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素處理組（秦皮甲素0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmo1/L），每孔200 μL。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后終止反應，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用翻板法將上清棄去，每孔加入DMSO 150μL，在搖床上振動混勻10 min。在酶標儀上490 nm波長處檢測各孔吸光度（A）值。抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照孔A值）×100%。實驗重復3次，計算平均抑制率。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡

取人肺癌細胞A549按4×104個/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，待細胞長至對數(shù)生長期時，將細胞分為陰性對照組、陽性對照組（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素處理組（秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmo1/L）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出細胞，用0.25%胰酶消化，5 mL PBS洗細胞兩次，800×g離心5 min，收集細胞至檢測管內(nèi)。采用Annexin V-FITC染色，加入10μL AnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，在1 h內(nèi)用流式細胞儀進行測定。數(shù)據(jù)經(jīng)Bioconsort專用軟件處理，分析細胞凋亡率。

2.4分光光度法檢測半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性 細胞分組、處理同“2.3”項。然后按照試劑盒的說明進行操作。600×g 4℃離心5 min，收集細胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次。每個樣品均加入裂解液150μL，重懸沉淀，冰浴裂解細胞15 min，然后16 000×g 4℃離心15 min，將上清小心轉移至冰浴預冷的空白EP管中。96孔板中每孔依次加入檢測緩沖液60μL，待測樣品30 μL，底物Ac-IETD-ρNA 10μL，小心混勻。37℃避光孵育6 h，405 nm處測定樣品吸光值，樣品吸光值減去對照組吸光值即為樣品中caspase催化產(chǎn)生ρNA的吸光度值。再通過標準曲線計算，即可反映caspase酶活性的大小。結果用試驗組A405值/對照組A405值的比值來表示。

2.5免疫印跡法檢測ERK1/2，p-ERK，K-Ras蛋白表達的變化 細胞分組、處理同“2.3”項。然后一步法裂解細胞，在4℃時12 500 r/min離心5 min，取上清液進行蛋白濃度的測定。用10%SDSPAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上。加入1∶1 000稀釋一抗，4℃過夜，洗膜。再加入1∶1 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，洗膜4次，每次15 min。最后顯色，照相。

2.6統(tǒng)計學處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1秦皮甲素對人肺癌細胞增殖的影響 秦皮甲素作用于人肺癌A549細胞48 h后，顯著抑制肺癌細胞的增殖。并且隨著秦皮甲素濃度的升高，抑制率也明顯增大。秦皮甲素的IC50值為0.4 mmo1/L。結果見表1。

表1　秦皮甲素對人肺癌細胞A549增殖的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

表1　秦皮甲素對人肺癌細胞A549增殖的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

注：與陰性對照組比較，★★P＜0.01

組 別檢測濃度/（mmo1·L-1）吸光度值抑制率/ % 0 0.872±0.19 0陽性對照組（5-Fu）0.77 0.312±0.13★★64.2秦皮甲素組0.1 0.559±0.20★★35.9秦皮甲素組0.2 0.470±0.17★★46.1秦皮甲素組0.4 0.436±0.25★★50秦皮甲素組0.8 0.301±0.23★★65.4秦皮甲素組1.6 0.246±0.15★★陰性對照組71.8

3.2秦皮甲素對人肺癌細胞凋亡的影響 應用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測凋亡，Annexin V可與凋亡早期翻轉到膜外的磷脂酰絲氨酸特異性結合。PI能夠透過凋亡中、晚期細胞和死細胞的細胞膜而使細胞核紅染。因此Annexin V與PI合用，可以將凋亡早期和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開。秦皮甲素作用于人肺癌A549細胞48 h后，隨著秦皮甲素濃度的升高，凋亡現(xiàn)象明顯，結果見圖1。

圖1　秦皮甲素對人肺癌細胞A549凋亡的影響Fig.1　Effects of escu Iin on apop tosis in human Iung cancer A549

3.3秦皮甲素對人肺癌A549細胞caspase3、8、9表達的影響 由表2可見，秦皮甲素作用于人肺癌A549細胞后，caspase3和caspase9的表達隨秦皮甲素濃度的升高而增強，caspase8的表達無明顯改變。

表2　秦皮甲素對人肺癌細胞A549caspase3、8、9表達的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

表2　秦皮甲素對人肺癌細胞A549caspase3、8、9表達的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

1.0 1.0 1.0 5-Fu 0.77 mmo1/L 1.37±0.25*1.58±0.08*1.03±0.22*秦皮甲素0.4 mmo1/L 1.16±0.09*1.24±0.14*0.99±0.10*秦皮甲素0.8 mmo1/L 1.34±0.12*1.63±0.21*1.08±0.05*秦皮甲素1.6 mmo1/L 1.79±0.30**2.05±0.18*1.05±0.20 caspase3 caspase9 caspase8陰性對照組組 別*

3.4秦皮甲素對人肺癌細胞ERK1/2，p-ERK1/2，K-Ras蛋白表達的影響 秦皮甲素作用于人肺癌A549細胞48 h后，K-Ras蛋白的表達減弱，ERK1/2蛋白的表達無明顯改變，p-ERK1/2蛋白的表達明顯降低，見圖2。結果顯示，秦皮甲素可以顯著抑制K-Ras的表達和ERK1/2的磷酸化水平。

4　討論

秦皮甲素是中藥秦皮中的主要有效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗病毒、抗氧化等作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)秦皮甲素在體內(nèi)外均顯示抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。可抑制化學致癌物1，2-二甲肼誘導的大鼠結腸DNA氧化損傷和腫瘤生長［1］。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，目前已知兩種信號途徑可以誘導細胞凋亡的發(fā)生，即外源性途徑作用于半胱氨酸蛋白酶caspase8；內(nèi)源性途徑作用于半胱氨酸蛋白酶caspase9，二者最終都活化下游caspase3，誘導細胞凋亡［3-8］。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著秦皮甲素濃度升高，細胞凋亡率增大的同時可使半胱氨酸蛋白酶caspase9、caspase3活性增強，而對caspase8的活性沒有影響。由此可見，秦皮甲素可以通過內(nèi)源性途徑誘導細胞凋亡。因為在細胞凋亡過程中ERK通路發(fā)揮著重要的作用，因此本實驗進一步研究了秦皮甲素是否參與了ERK信號通路的調(diào)節(jié)作用。

圖2　秦皮甲素對人肺癌細胞ERK1/2，p-ERK 1/2，K-Ras蛋白表達的影響Fig.2　Effects of escu Iin on expressions of protein ERK 1/2，p-ERK1/2，K-Ras in human Iung cancer ceIIA549

Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途徑，K-Ras蛋白是人類腫瘤中最常見的突變類型，ERK1/2是其下游信號分子。ERK1/2是決定細胞命運的關鍵分子，決定著細胞的分裂增殖、終末分化或進入凋亡程序。ERK1/2激活后進入細胞核內(nèi)，可激活或滅活其他信號轉導途徑的關鍵效應分子，調(diào)節(jié)相應靶基因轉錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，最終促進細胞增殖和惡性轉化，阻止細胞凋亡，同時產(chǎn)生多種細胞因子，刺激細胞生長［9-11］。

本實驗通過細胞免疫印跡試驗發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素作用于人肺癌A549細胞48 h后，可顯著抑制KRas的表達和ERK1/2的磷酸化水平。結果顯示秦皮甲素可通過抑制K-Ras及其下游信號分子的活化而誘導細胞凋亡。ERK信號通路作為一條將細胞外信息向細胞核傳遞的通路，在細胞增殖和凋亡過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［12-13］，因此有可能成為治療肺癌的新靶點。

綜上所述，秦皮甲素可以抑制人肺癌細胞A549的增殖，并通過內(nèi)源性途徑誘導凋亡。但是，秦皮甲素在誘導細胞凋亡的過程中還有哪些信號分子參與其中，是否影響腫瘤血管的形成等等，這些作用機制尚需進行深入研究。

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Escu Iin induces A549 Iung cancer ceIIapoptosis by inhibiting Ras/ERK pathway

WANG Jing
（First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

AIM To exp1ore the escu1in's possib1e effect of inducing apoptosis of A549 1ung cancer ce11 through inhibiting the Ras/ERK pathway.METHODS A549 1ung cancer ce11pro1iferation wasmeasured by MTT method，ce11apoptosiswas detected by f1ow cytometry，the activities of cysteine protease caspase-3，8，9 were determined by spectrophotometric method.The protein expression changes of K-Ras，extrace11u1ar signa1 regu1ating kinase1/2（ERK1/2），phosphory1ated ERK1/2（p-ERK1/2）were determined by Western-b1ot.RESULTS Escu1in inhibited the pro1iferation of human A549 1ung cancer ce11s and induced its apoptosis with a IC50of 0.4 mmo1/L，and the activities of caspase-3，caspase-9 increased whi1e caspase-8 did not show any significant change. Protein expression of p-ERK and K-Ras decreased and ERK1/2 remained the same.CONCLUSION The data demonstrats that escu1in-induced apoptosis in A549 1ung cancer ce11 is performed by inhibiting the Ras protein expression and ERK phosphory1ation.

escu1in；A549 1ung cancer ce11；Ras/ERK pathway；apoptosis

R966

A

1001-1528（2015）01-0040-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.007

2014-02-15

遼寧省自然科學基金項目（2013022063）

王 晶（1974—），女，主管藥師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理。Te1：15004162307，E-mai1：wangjing2006050@126.com