HPLC法測定出血熱預防片中的女貞苷、特女貞苷、哈巴苷和哈巴俄苷

錢永健，　張 超

（1.廣州醫科大學藥學院，廣東　廣州　510182；2.廣州市婦女兒童醫療中心，廣東　廣州　510623）

HPLC法測定出血熱預防片中的女貞苷、特女貞苷、哈巴苷和哈巴俄苷

錢永健1，2，張 超1*

（1.廣州醫科大學藥學院，廣東廣州510182；2.廣州市婦女兒童醫療中心，廣東廣州510623）

目的 建立高效液相色譜法測定出血熱預防片中女貞苷、特女貞苷、哈巴苷和哈巴俄苷的定量測定方法。方法采用依利特Hypersi1C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；體積流量1.0 mL/min；女貞苷和特女貞苷的檢測流動相為甲醇-0.1%磷酸（42∶58），檢測波長為224 nm；哈巴苷和哈巴俄苷的檢測流動相為乙腈-0.03%磷酸溶液，哈巴苷檢測波長為210 nm，哈巴俄苷檢測波長為280 nm。結果 女貞苷和特女貞苷分別在0.012 6～0.252 0μg（r= 0.999 2）、0.073 2～1.464 0μg（r=0.999 6）范圍內進樣量與峰面積的線性關系良好，平均回收率分別為97.1%、98.2%，RSD（n=6）分別為1.0%、1.1%。哈巴苷和哈巴俄苷分別在0.095 2～1.904 0μg（r=0.999 5）、0.013 4～0.268 0μg（r=0.999 1）范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為98.7%、97.0%，RSD（n=6）分別為0.7%、0.9%。結論 本方法簡便、快捷，結果準確，重復性好，可應用于出血熱預防片的質量控制。

出血熱預防片；女貞苷；特女貞苷；哈巴苷；哈巴俄苷

出血熱預防片為衛生部藥品標準中藥成方制劑第十二冊收錄處方，由女貞子、玄參、地黃、白茅根、丹參、丹皮和板藍根等七味藥物組成。具有涼血化瘀、清熱解毒的功效，可用于預防流行性出血熱。原質量標準僅對個別藥味進行了顯微鑒別，未對方中的任何藥味進行定性或定量測定［1-2］。為保證產品質量，確保臨床療效，本實驗采用高效液相色譜法對女貞子中女貞苷、特女貞苷和玄參中哈巴苷、哈巴俄苷進行了測定。

1　儀器與材料

1.1儀器 Agi1ent 1200高效液相色譜儀；G1322A脫氣機、G1329A自動進樣器、G1311A四元泵、Chemstation色譜工作站；G1315B可變波長檢測器。

1.2材料 女貞苷對照品（批號111918-201102，純度以88.6%計）、特女貞苷對照品（批號111926-201203，純度以96.4%計）、哈巴苷對照品（批號111729-201204，純度以94.5%計）和哈巴俄苷對照品（批號111730-201207，純度以97.1%計）均購于中國食品藥品檢定研究院；出血熱預防片（每片相當原生藥0.667 5 g，素片0.3 g/片，包糖衣后0.5 g/片，批號分別為130719、130725、130729）自制；甲醇、乙腈（色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司）；磷酸（分析純，廣州化學試劑二廠）；水為重蒸餾水。

2　方法與結果

2.1女貞苷和特女貞苷的定量分析

2.1.1色譜條件及系統適應性試驗 依利特Hypersi1C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；甲醇-0.1%磷酸（42∶58）為流動相［3-6］，檢測波長224 nm［6-9］；體積流量1.0 mL/min。在上述色譜條件下，女貞苷、特女貞苷與其他組分分離效果良好，理論塔板數以女貞苷計算應不低于3 000。

2.1.2混合對照品及供試品溶液的制備 精密稱取女貞苷、特女貞苷對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成含女貞苷0.012 6 mg/mL、特女貞苷0.073 2 mg/mL的混合對照品溶液。取適量本品，除去糖衣，研細，取約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲波（300 W，25 kHz）超聲25 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3陰性對照試驗 依據出血熱預防片處方比例稱取除女貞子的其他藥味，按出血熱預防片的制備工藝制成女貞子空白樣品，按照“2.1.2”項下供試品溶液的配制方法制成女貞子空白溶液。分別精密吸取10μL的供試品溶液、混合對照品溶液及女貞子空白溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件進行色譜分析，空白溶液對樣品測定無干擾，結果見圖1。

圖1　女貞苷和特女貞苷的HPLCFig.1　HPLC of IigustrofIavone and specnuezhenide determ ination

2.1.4線性關系考察 精密量取混合對照品溶液1、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，女貞苷、特女貞苷量為橫坐標進行線性回歸，得兩種成分的回歸方程。女貞苷為Y=2.168 7×106Ⅹ-394.1，r= 0.999 2；特女貞苷為Y=3.154 2×106Ⅹ+631.2，r=0.999 6。結果表明女貞苷、特女貞苷分別在0.012 6～0.252 0μg、0.073 2～1.464 0μg進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件重復進樣6次，記錄女貞苷和特女貞苷的峰面積，RSD分別為0.7%、0.4%，表明儀器具有良好的精密度。

2.1.6重復性試驗 取同一批樣品（批號130719），按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定，女貞苷和特女貞苷的RSD分別為0.8%、0.3%。結果表明本方法重復性良好。

2.1.7穩定性試驗 取同一批樣品（批號130719）的同一供試品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10μL進樣，測定其峰面積值，女貞苷和特女貞苷的RSD分別為0.7%、0.4%，供試品溶液8 h內基本穩定。

2.1.8加樣回收率試驗 取已知含有量（女貞苷0.648 mg/g，特女貞苷3.64 mg/g）的同一批樣品（批號130719）適量，除去糖衣，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加混合對照品溶液25 mL、甲醇25 mL，超聲波（300 W，25 kHz）超聲25 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜濾過，制成加樣供試液。精密吸取加樣供試液10μL，進樣分析，計算回收率，結果見表1。

表1　女貞苷和特女貞苷回收率試驗結果Tab.1 Resu Its of recovery tests for IigustrofIavone and specnuezhenide

2.2哈巴苷和哈巴俄苷的定量分析

2.2.1色譜條件及系統適應性 Hypersi1C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.03%磷酸溶液［10-13］，梯度洗脫（0～11 min，40.0%A；11～25 min，40.0%→65.0% A；25～50 min，65.0%A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長λ1=210 nm（0～25 min），λ2=280 nm（25～50 min）。在上述色譜條件下，哈巴苷、哈巴俄苷與其他組分基線分離良好，以哈巴俄苷計理論塔板數應不低于3 500。

2.2.2混合對照品及供試品溶液的制備 精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷對照品適量，加50%甲醇溶解并定容，制成含哈巴苷0.095 2 mg/mL、哈巴俄苷為0.013 4 mg/mL的混合對照品溶液。取本品適量，除去糖衣，研細，取約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，超聲波（300 W，25 kHz）超聲30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照試驗 依據出血熱預防片處方比例稱取除玄參的其他藥味，按出血熱預防片的制備工藝制成玄參空白樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液的配制方法制成玄參空白溶液。分別精密吸取10μL的供試品溶液、混合對照品溶液及玄參空白溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進行色譜分析，空白溶液對測定無干擾，結果見圖2。

圖2　哈巴苷和哈巴俄苷的HPLCFig.2　HPLC chromatograms of harpagide and harpagoside

2.2.4線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，哈巴苷、哈巴俄苷進樣量為橫坐標進行線性回歸，得兩種成分的回歸方程。哈巴苷為Y=2.624 9×106Ⅹ+264.7，r= 0.999 5；哈巴俄苷為Y=2.016 2×106Ⅹ-348.3，r=0.999 1。結果表明哈巴苷、哈巴俄苷分別在0.095 2～1.904 0μg、0.013 4～0.268 0μg范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5穩定性試驗 取同一批樣品（批號130719）的同一供試品溶液，在放置0、1、2、4、6、8 h后精密吸取10μL進樣，測定其峰面積值，哈巴苷和哈巴俄苷的RSD分別為0.5%、0.9%，供試品溶液8 h內基本穩定。

2.2.6精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液重復進樣6次，按以上色譜條件測定哈巴苷和哈巴俄苷的峰面積，RSD分別為0.4%、0.8%，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.7重復性試驗 取同一批樣品（批號130719），按上述方法制備6份供試品溶液，分別測定，哈巴苷和哈巴俄苷的RSD分別為0.4%、0.6%。結果表明本方法具有良好的重復性。

2.2.8加樣回收率試驗 取已知含有量（哈巴苷4.78 mg/g、哈巴俄苷0.682 mg/g）的同一批樣品（批號130719），除去糖衣，研細，取約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加混合對照品溶液25 mL，50%甲醇25 mL，超聲波（300 W，25 kHz）超聲30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜濾過，制成加樣供試液。精密吸取加樣供試液10μL，進樣分析，計算回收率，結果見表2。

表2　哈巴苷和哈巴俄苷回收率試驗Tab.2 Resu Its of recovery tests for harpagide and harpagoside

2.3樣品測定 取3批樣品按“2.1”項下女貞苷和特女貞苷測定方法和“2.2”項下哈巴苷和哈巴俄苷測定方法測定其中4個成分的量，結果見表3。

3　討論

3.1流動相的選擇 實驗中曾采用乙腈與0.03%磷酸溶液、甲醇與0.1%磷酸為流動相以不同比例梯度洗脫同時測定以上4種成分，結果以乙腈與0.03%磷酸溶液為流動相不同比例梯度洗脫時，哈巴苷和哈巴俄苷能達到基線分離，而女貞苷和特女貞苷分離效果差，不能有效分離；以甲醇與0.1%磷酸為流動相不同比例梯度洗脫時，哈巴俄苷達不到有效分離，峰型差，拖尾現象嚴重，其他3個成分峰型良好。故本實驗采用兩種不同流動相對處方中的4個主要成分進行了測定，以有效控制產品的質量。

表3　樣品測定結果Tab.3 Resu Its of content determ ination

3.2提取方式的選擇 考慮到制劑生產時檢驗的便捷性，采用超聲（300 W，25 kHz）提取進行試驗，女貞苷和特女貞苷提取時間參考文獻分別以20、25、30 min進行考察，哈巴苷和哈巴俄苷提取時間參考文獻分別以20、30、40 min進行考察，結果女貞苷和特女貞苷測定時樣品提取最佳時間為25 min，哈巴苷和哈巴俄苷測定時樣品提取最佳時間為30 min。

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Determ ination of IigustrofIavone，specnuezhenide，harpagide and harpagoside in Chuxuere Yufang
Tab Iets by HPLC

QIAN Yong-jian1，2， ZHANG Chao1*
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China；2.Guangzhou Women and Children'sMedical Center，Guangzhou 510623，China）

AIM To deve1op an HPLC method for determining the contents of 1igustrof1avone，specnuezhenide，harpagide and harpagoside in Chuxuere Yufang
Tab1ets.M ETHODS An Hypersi1C18co1umn was used as the chromatographic co1umn，the f1ow rate was 1.0 mL/min.Measurement of 1igustrof1avone and specnuezhenide wasmade usingmethano1-0.1%phosphoric acid（42∶58）as themobi1e phase，and setting UV detection wave1ength at254 nm.Measurementof harpagide and harpagosidewasmade using acetonitri1e asmobi1e phase A and 0.03%phosphoric acid asmobi1e phase B，setting the UV detection wave1ength at 210 nm and 280 nm. RESULTS The good 1inear re1ationships between the concentration and peak area were in the ranges of0.012 6-0.252 0μg（r=0.999 2）for 1igustrof1avone，0.073 2-1.464 0μg（r=0.999 6）for specnuezhenide，respective1y.Their average recoveries were 97.1%（RSD=1.0%）and 98.2%（RSD=1.1%），respective1y.The good 1inear re1ationships between the concentration and peak area va1ue were in the range of0.095 2-1.904 0μg（r=0.999 5）for harpagide、0.013 4-0.268 0μg（r=0.999 1）for harpagoside，respective1y.Their average recoveries were 98.7%（RSD=0.7%）and 97.0%（RSD=0.9%），respective1y.CONCLUSION The method is simp1e，accurate and reproducib1e and can be used for the qua1ity contro1of Chuxuere Yufang
Tab1ets.

Chuxuere Yufang
Tab1ets；1igustrof1avone；specnuezhenide；harpagide；harpagoside

R927.2

A

1001-1528（2015）01-0116-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.023

2014-04-02

錢永健（1980—），男，藥師，主要從事臨床藥學服務。E-mai1：qianyongjian1unwen@163.com

張 超（1964—），男，副教授，主要從事藥物化學和天然藥物化學研究。E-mai1：zhangchao1unwen1@163.com