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達(dá)原飲解熱作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

2015-10-19 02:17:19任慧玲梁之桃趙中振
中成藥 2015年1期
關(guān)鍵詞:研究進(jìn)展

任慧玲, 嚴(yán) 彪, 梁之桃, 趙中振, 董 燕, 張 健*

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 蘇州 215123;2.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中國 香港 999077)

達(dá)原飲解熱作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

任慧玲1,嚴(yán) 彪1,梁之桃2,趙中振2,董 燕1,張 健1*

(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院,江蘇蘇州215123;2.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,中國香港999077)

目的 研究達(dá)原飲對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠發(fā)熱模型的解熱作用及其機(jī)制,采用UPLC/Q-TOF-MS法分析達(dá)原飲乙醇提取物中的化學(xué)成分。方法 大鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立發(fā)熱模型,藥物處理后連續(xù)監(jiān)測體溫8 h,觀察大鼠體溫變化;運(yùn)用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清IL-6、TNF-α水平,MPO試劑盒檢測肝組織MPO活性。采用UPLC/Q-TOF-MS法,分析達(dá)原飲乙醇提取物的化學(xué)成分。結(jié)果 達(dá)原飲對(duì)LPS引起的大鼠發(fā)熱具有明顯的解熱作用,顯著降低血清中TNF-α、IL-6水平及肝組織中的MPO活性。正離子模式下檢測出達(dá)原飲乙醇提取物中48個(gè)化合物。結(jié)論 達(dá)原飲具有顯著的解熱作用,其作用機(jī)制與降低血清中IL-6、TNF-α水平,降低肝組織中MPO活性有關(guān)。通過UPLC/Q-TOFMS分析,達(dá)原飲的主要化學(xué)成分為黃酮、皂苷、生物堿和有機(jī)酸類化合物。

達(dá)原飲;解熱;脂多糖(LPS);UPLC/Q-TOF-MS

達(dá)原飲出自吳又可所著《瘟疫論》,由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味藥物組成,用于瘟疫或瘧疾邪伏膜原之憎寒壯熱,胸悶嘔惡,頭痛煩躁,脈弦數(shù),舌邊深紅、苔垢膩等癥,具有開達(dá)膜原、辟穢化濁之功[1]。目前,對(duì)達(dá)原飲臨床治療發(fā)熱的研究已有多篇報(bào)道,但作用機(jī)制不明[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠發(fā)熱模型,研究達(dá)原飲的解熱作用,對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,并采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù),通過與對(duì)照品比較,質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,參考相關(guān)文獻(xiàn)初步分析達(dá)原飲乙醇提取物的化學(xué)成分[3-12],為進(jìn)一步探討達(dá)原飲解熱功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 解熱實(shí)驗(yàn)

1.1材料和試劑

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,合格證號(hào)NO.SCXK(蘇)2009-0001。體質(zhì)量(200±10)g,自由飲食飲水,環(huán)境溫度控制于(28±0.5)℃。

1.1.2藥物及試劑 各味藥材均購買于蘇州市天靈中藥飲片有限公司(藥材提取物干燥后,混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中);羧甲基纖維素鈉800~1200(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);阿司匹林(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字H32026500);脂多糖LPS 055:B5 L2880(Sigma公司);MPO測試盒(南京建成賽浩科技有限公司);大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海船夫貿(mào)易有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水,生理鹽水。

1.1.3儀器 BT-A21型電子體溫計(jì)(深圳市福達(dá)康實(shí)業(yè)有限公司東莞分公司);EL303電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);ME215P-OCE電子天平(德國Sartorius AG公司);TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);ELx800酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司);DL-360A超聲波清洗器(上海科島超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1藥物的制備

1.2.1.1阿司匹林混懸液的配制 0.59 g/片,2片藥加50 mL生理鹽水,用玻棒搗碎,置于水浴振蕩器上震蕩溶解,過濾,制成20 mg/mL溶液,封口,滅菌,冰箱保存?zhèn)溆茫粚PS溶于無菌生理鹽水中,配成質(zhì)量濃度為20μg/mL的溶液。

1.2.1.2達(dá)原飲水提物制備 稱取檳榔(BL)28.6 g,厚樸(HP)14.3 g,知母(ZM)14.3 g,白芍(BS)14.3 g,黃芩(HQ)14.3 g,草果(CG)7.1 g,甘草(GC)7.1 g,用500 mL水提取,回流2 h,提取2次,合并,減壓濃縮干燥得達(dá)原飲水提物。

1.2.1.3達(dá)原飲乙醇提取物制備 稱取同樣質(zhì)量各味藥材,加入500 mL 95%乙醇回流提取2次,合并,減壓濃縮干燥得達(dá)原飲醇提物。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 造模前,每日早晚測量各組大鼠的肛溫,連續(xù)測定3 d,每次測之前電子體溫計(jì)探頭上涂凡士林,插入大鼠直腸2 cm,選取體溫在36.6~38.3℃,且連續(xù)體溫變化小于0.5℃的大鼠,取其平均值作為正常基礎(chǔ)體溫。按照體溫基礎(chǔ)值和體質(zhì)量均衡隨機(jī)分成5組(每組10只):空白組(A)、模型組(B)、達(dá)原飲水提物組(C)、達(dá)原飲醇提物組(D)、阿司匹林對(duì)照組(E)。B、C、D、E組腹腔注射LPS(100 μg/kg),A組注射同體積生理鹽水,30 min后,C、D組分別灌胃給達(dá)原飲水提物(936 mg/kg)和醇提物(365 mg/kg),相當(dāng)于生藥量4.2 g/kg、E組灌胃給藥阿司匹林(200 mg/kg),于給藥后1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8 h分別測定肛溫,記錄各組體溫?cái)?shù)據(jù),與基礎(chǔ)體溫比較,計(jì)算各時(shí)段溫差。各時(shí)段溫差=各時(shí)段體溫(℃)-基礎(chǔ)體溫(℃)。

1.2.3炎癥因子TNF-α和IL-6的測定 大鼠造模后8 h,眼眶取血,4℃1500×g離心20 min,取上清液備用。按試劑盒說明測定血清TNF-α和IL-6水平,酶標(biāo)儀上讀取OD450。

1.2.4髓過氧化物酶(MPO)活性的測定 嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定460 nm下吸光度(A)。MPO(U/g)=(測定管A-對(duì)照管A)/ 11.3×取樣量(g)。

1.3結(jié)果

1.3.1達(dá)原飲對(duì)LPS引起大鼠發(fā)熱模型的解熱效應(yīng) 達(dá)原飲對(duì)大鼠直腸溫度的影響,見圖1,空白組大鼠體溫在整個(gè)過程中體溫相對(duì)恒定。模型組(B)給予LPS 100μg/kg后,各鼠在3.5~4 h左右出現(xiàn)一個(gè)發(fā)熱峰,部份大鼠還出現(xiàn)不同程度腹瀉等癥狀,C、D、E組分別給達(dá)原飲水提物、達(dá)原飲醇提物和阿司匹林后,體溫明顯低于模型組。

1.3.2達(dá)原飲對(duì)LPS發(fā)熱大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO的影響 結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組在腹腔注射LPS后,血清中IL-6、TNF-α和肝組織中MPO活性明顯增加,而達(dá)原飲則不同程度地降低TNF-α、IL-6及MPO的活性(P<0.05),見表1。

圖1 達(dá)原飲對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響(n=10)Fig.1 Effect of Dayuanyin on body tem perature in LPS-induced fever rats(n=10)

表1 達(dá)原飲對(duì)發(fā)熱大鼠血清及肝組織各致熱因子的影響(±s,n=10)Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats(±s,n=10)

表1 達(dá)原飲對(duì)發(fā)熱大鼠血清及肝組織各致熱因子的影響(±s,n=10)Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats(±s,n=10)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,ΔP<0.05

組別MPO/(U·g-1)TNF-α/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)0.70±0.058 5.65±1.40 129.00±21.25模型組1.70±0.27*53.80±10.30*501.67±92.11*達(dá)原飲水提物組0.78±0.09Δ16.95±3.82Δ222.67±36.75Δ達(dá)原飲醇提物組1.14±0.23Δ34.05±8.45Δ373.67±55.63Δ阿司匹林對(duì)照組0.67±0.11Δ5.35±1.73Δ147.67±21.42空白組Δ

2 UPLC-Q-TOF/MS分析

2.1儀器和試藥 ACQUITY UPLC/Q-TOF MS系統(tǒng)(美國Waters公司),采用電噴霧電離(ESI),二元高壓泵,在線脫氣裝置,自動(dòng)進(jìn)樣器,數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter軟件;UPLC C18分析柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm,ACQUITY UPLC BEH,Waters,USA);數(shù)據(jù)采集與處理采用MassHunter軟件;所有試劑均為色譜純(E.Merck,Darmstadt,Germany),水為超純水系統(tǒng)制備得到(Mi11ipore,Bedford,MA,USA)。

氫溴酸檳榔堿、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黃芩苷、芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品均購于成都瑾哲生物科技有限公司。

2.2樣品和對(duì)照品制備 稱取檳榔28.6 g,厚樸14.3 g,知母14.3 g,白芍14.3 g,黃芩14.3 g,草果7.1 g,甘草7.1 g,分別用500 mL 95%乙醇提取,回流提取2次。將提取液旋干,用甲醇超聲溶解,制成1 mg/mL的供試品溶液。分別稱取適量氫溴酸檳榔堿、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黃芩苷、芍藥苷、厚樸酚、和厚樸酚,加入甲醇配成相應(yīng)的溶液,量取上述溶液適量,混合均勻,配成含有上述各對(duì)照品質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3方法與條件

2.3.1色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫(0~18 min,2%~15%B;18~25 min,15%~35%B;25~30 min,35%~70%B;30~31 min,70%~100%B);體積流量0.4 mL/min;柱溫20℃;進(jìn)樣體積1.0μL。

2.3.2質(zhì)譜條件 Agi1ent 6540 accurate mass QTOF LC/MS(Agi1ent Techno1ogies,USA)系統(tǒng),配有電噴霧離子源(正離子模式)和MassHunter數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),霧化氣溫度為300℃,霧化氣體積流量8.0 L/min,脫溶劑氣(N2)體積流量8.0 L/min,毛細(xì)管電壓為3 500 V(正離子模式),噴嘴電壓為500 V,掃描范圍m/z 100~1 700。

2.4結(jié)果 達(dá)原飲乙醇提取物的正離子模式下色譜圖見圖2,與平衡比較,對(duì)比所加對(duì)照品的BPC(base peak chromatogram)圖譜,參照各個(gè)藥材的圖譜,確定48個(gè)共有峰,并對(duì)各共有峰進(jìn)行歸屬判斷,結(jié)果顯示,峰2、15、16、24、35、45為有機(jī)酸類化合物。峰1、4、6、8、14、43為生物堿類化合物,主要來源于厚樸、草果。峰18、36、39為甾體皂苷類化合物,主要來源于知母。峰27、40、41、42、48為三萜皂苷類化合物,主要來源于甘草。峰3、5、10、11、13、17、19、20、21、22、23、26、28、29、30、31、33、34、37、41為黃酮類化合物,主要來源于黃芩。分析各峰的質(zhì)譜圖,依據(jù)分子離子峰及碎片離子,參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-12],確定推測化合物,初步鑒定結(jié)果見表2。

圖2 BPC圖譜Fig.2 Peak numbers refered to base peak chromatogram

續(xù)圖2 BPC圖譜Fig.2 Peak numbers refered to base peak chromatogram

表2 達(dá)原飲UPLC-ESI-TOF/MS色譜圖中各峰的測定數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果Tab.2 M easurement data and the identification resu Its of Dayuanyin by UPLC-Q-TOF-MS

續(xù)表2

3 討論

解熱實(shí)驗(yàn)中給予大鼠LPS 100μg/kg腹腔注射后,出現(xiàn)典型三相熱,其中以4 h的體溫上升最顯著,最大幅度達(dá)1.4℃,同時(shí)伴隨寒顫精神萎靡和腹瀉等癥狀,這與臨床感染的炎癥性發(fā)熱極其相似。但給予阿司匹林和達(dá)原飲治療后,LPS誘導(dǎo)的三相發(fā)熱反應(yīng)顯著降低,表明了阿司匹林和達(dá)原飲對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠發(fā)熱反應(yīng)具有明顯抑制作用。MPO是存在于中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中的酶,發(fā)生炎癥時(shí),可以被活化的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所釋放;因此,通過測量MPO活性可以間接判斷組織炎性細(xì)胞浸潤程度。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),模型組在給予LPS 100μg/kg腹腔注射后,大鼠肝組織中MPO活性明顯升高,但經(jīng)達(dá)原飲治療后(實(shí)驗(yàn)D、E組),在體溫下降的同時(shí)肝臟中MPO表達(dá)量也明顯降低[13]。腫瘤壞死因子(TNF-α)主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,為內(nèi)源性炎性致病因子,在炎癥反應(yīng)中起到重要作用[14];IL-6是一種炎癥細(xì)胞因子,在發(fā)生炎癥等情況下,血清中IL-6會(huì)顯著增加。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),模型組在給予LPS腹腔注射后,大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及肝組織中的MPO活性明顯升高,但經(jīng)達(dá)原飲處理后則在體溫下降的同時(shí)血清中TNF-α、IL-6水平和肝臟中MPO表達(dá)量也明顯降低。由此推測,達(dá)原飲通過抑制外周肝組織炎癥反應(yīng)和降低內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子的分泌而產(chǎn)生解熱效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)達(dá)原飲解熱作用的研究確定了其解熱作用,為了進(jìn)一步確定活性成分,采用了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)達(dá)原飲乙醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,在高效分離的基礎(chǔ)上,測定了部分成分的相對(duì)分子質(zhì)量,對(duì)達(dá)原飲的主要化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方達(dá)原飲中的化學(xué)成分主要為黃酮、皂苷、生物堿和有機(jī)酸類。黃芩的主要活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷等黃酮類化合物,其中,黃芩素和黃芩苷具有一定的解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用,其作用機(jī)制主要與抑制PGE2分泌,抑制核因子的活性以及細(xì)胞因子的分泌具有密切的關(guān)系[15-16]。知母中的知母皂苷B-Ⅱ具有體外抗炎活性,在mRNA和蛋白表達(dá)水平可抑制IL-1、TNF-α和IL-6等炎癥因子的生成,同時(shí)抑制細(xì)胞核因子-B(NF-κB)和促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶(p38MAPkinase)的激活[17]。甘草中的甘草酸、甘草多糖和甘草黃酮類化合物具有抗炎活性[18]。此外,白芍[19]和草果[20]也具有抗炎作用。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明達(dá)原飲可能是通過抑制外周肝組織炎癥反應(yīng)和降低內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子的分泌而產(chǎn)生解熱效應(yīng)。而達(dá)原飲的UPLC-Q-TOF/MS化學(xué)成分分析也表明,達(dá)原飲含有大量來源于黃芩的黃酮類化合物、及知母中知母皂苷B-Ⅱ等,由此,我們推測達(dá)原飲發(fā)揮解熱作用的化學(xué)成分可能主要來源于黃芩中的黃酮類化合物,知母中的知母皂苷B-Ⅱ等。對(duì)比各味藥與達(dá)原飲的色譜圖,發(fā)現(xiàn)單味藥中的許多峰在達(dá)原飲中并沒有出現(xiàn),這可能由于這些成分量太低未被檢測出。通過對(duì)比達(dá)原飲水提物和醇提物的液相色譜圖,發(fā)現(xiàn)醇提物與水提物所含化學(xué)成分總數(shù)基本一致,而且醇提物含有量較水提物高,有利于準(zhǔn)確推斷可能的有效成分,因此采用UPLC-Q-TOF/MS分析其乙醇提取物中的化學(xué)成分。目前,課題組正在對(duì)達(dá)原飲水提物進(jìn)行處理,將利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步確定達(dá)原飲的解熱活性部位,分析其藥效成分。

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AntifebriIe effect of Dayuanyin and its determ ination by UPLC/Q-TOF-MS

REN Hui-1ing1, YAN Biao1, LIANG Zhi-tao2, ZHAO Zhong-zheng2, DONG Yan1, ZHANG Jian1*
(1.College of Pharmaceutical Science,Soochow University,Suzhou 215123,China;2.School of Chinese Medicine,Hong Kong Baptist University,Kowloon,Hong Kong Special Administrative Region,999077,China)

AIM To observe the effect of Dayuanyin on LPS-induced febri1e response in rats and e1ucidate the antipyreticmechanism of Dayuanyin,and to ana1yze the chemica1 composition in ethano1 extract of Dayuanyin by UPLC/Q-TOF-MS.M ETHODS Fever was induced by intraperitonea11y injecting LPS(100μg/kg),and the temperaturewas observed for8 h,and the changes of temperaturewere observed.IL-6,TNF-α1eve1s and 1iver tissue MPO 1eve1s in ce11supernatantwere detected.Chemica1compositions of Dayuanyin were ana1yzed by UPLC/QTOF-MS.RESULTS Dayaunyin had significant antipyretic effect on rats induced by LPS,cou1d reduce the 1eve1 of TNF-αand IL-6 in serum,and decrease the activity ofMPO in 1iver tissue.Forty-eight compounds in the ethano1 extract of Dayuanyin had been detected in the positive ionmode.CONCLUSION Dayaunyin has significant antipyretic effect by decreasing the 1eve1of IL-6 and TNF-αin serum and reducing the contentof MPO in 1iver tissue. Ana1yzed by UPLC/Q-TOF-MS,themain chemica1compositions of Dayuanyin are f1avonoids,saponins,a1ka1oids,organic acids.

Dayuanyin;antipyretic effect;1ipopo1ysaccharide(LPS);UPLC/Q-TOF-MS

R284.1

A

1001-1528(2015)01-0131-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.027

2014-01-16

江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目資助(2011)

任慧玲(1991—),女,碩士生。Te1:15295673203,E-mai1:renhui1ing91@163.com

張 健(1975—),女,博士,副教授,從事天然藥物活性研究。Te1:13814875226,E-mai1:jianzhang@suda.edu.cn

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