HPLC-UV法測定五味子中5-羥甲基糠醛

李 越，　安開龍，　李德坤，　楊悅武，　余伯陽，　鞠愛春*

（1.中國藥科大學，江蘇　南京　210009；2.南京農業大學，江蘇　南京　210095；3.天津天士力之驕藥業有限公司，天津　300402）

HPLC-UV法測定五味子中5-羥甲基糠醛

李 越1，安開龍2，李德坤3，楊悅武3，余伯陽1，鞠愛春3*

（1.中國藥科大學，江蘇南京210009；2.南京農業大學，江蘇南京210095；3.天津天士力之驕藥業有限公司，天津300402）

目的 建立五味子藥材中5-羥甲基糠醛（5-HMF）的定量測定方法。方法 采用HPLC-UV，Diamonsi1C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）；檢測波長284 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30℃。結果 5-羥甲基糠醛在1.14～18.21μg/mL范圍內線性關系良好，平均回收率為100.1%，RSD為1.0%。五味子鮮果和干燥種子中均未檢出5-HMF，干燥果肉中5-HMF含有量較高，12批五味子中5-羥甲基糠醛的含有量范圍為0.09～2.40 mg/g。結論 五味子中的5-羥甲基糠醛主要是由五味子鮮果果肉在加熱烘干過程中產生，不同批號的五味子中5-HMF的量差異較大。

五味子；5-羥甲基糠醛；HPLC-UV

五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Bai11.為木蘭科五味子屬Schisandra多年生左旋落葉木質藤本植物，其成熟果實干燥后作藥用，因其果實甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子［1］，主產于黑龍江、吉林、遼寧等地，習稱“北五味子”。具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功能。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗、盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內熱消渴、心悸失眠等癥［2］。五味子多為9月前后成熟，為漿果，果實含水量較高，采收后需及時加工干燥以利于貯存保證藥材品質。傳統多采用陰干、曬干等方式，因其需要大量勞動力且受天氣情況影響干燥過程不易控制，現多采用烘干的方式進行干燥。但是不同的干燥時間和干燥溫度對藥材品質具有重要影響［3］。

5-羥甲基糠醛（5-HMF），又稱5-羥甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下產生的一個醛類化合物，是Mai11ard反應的典型產物之一［4］，溫度對美拉德反應的影響較大，5-HMF的含有量隨著溫度的升高呈上升趨勢［5-6］。文獻中表述該化合物對人體橫紋肌和內臟有損害［7］，具有神經毒性，能與人體蛋白質結合產生積蓄中毒，《中國藥典》2010年版二部中明確規定了它在含葡萄糖注射液中的限量［8］。此外，近年來也有研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改變血液流變學等對人體有益的作用［9-10］。目前5-HMF測定主要為UV法和HPLC法［9］，五味子應用廣泛，在加工干制的過程中會產生5-HMF。目前文獻報道的有關五味子中5-HMF的定量測定多是以加熱煎煮提取5-HMF［3，11］，五味子藥材在加熱的過程中可能會產生新的5-HMF，造成測量結果不能客觀地反映原始藥材中5-HMF的量。因此，本實驗采用冰浴超聲提取五味子藥材中的5-HMF，避免加熱對5-HMF含有量的影響，建立五味子藥材中5-HMF定量測定的HPLC法，為藥材的質量控制提供科學依據。

1　儀器和試藥

1.1儀器與試劑 Agi1ent1100型高效液相色譜儀（美國Agi1ent公司），萬分之一天平（AL204梅特勒-托利多儀器有限公司），十萬分之一天平（XS105梅特勒-托利多儀器有限公司），Mi11i-Q超純水機，電熱鼓風干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司制造），超聲波清洗器（KQ5200型，昆山市超聲波儀器有限公司），L-550低速自動平衡離心機（長沙湘儀離心儀器有限公司），WK-200B高速藥物粉碎機（青州市精誠機械有限公司）。

5-HMF對照品（批號111626-201308，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（色譜純），醋酸（色譜純），水為實驗室自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.2藥材 五味子鮮果于2013年9月15日采自遼寧省新賓縣，五味子干燥果實、種子和果肉由鮮果在相同的條件下烘干而成，20081001等12批五味子藥材由天津天士力之驕藥業有限公司提供（產地遼寧），以上藥材經中國藥科大學余伯陽教授鑒定。

2　方法與結果

2.1色譜條件 Diamonsi1C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）等度洗脫；體積流量1 mL/min；檢測波長284 nm；柱溫30℃；進樣量10μL；外標法定量。在本色譜條件下，5-HMF色譜峰分離較好。結果見圖1。

圖1　對照品（A）、樣品（B）和空白（C）HPLC圖譜Fig.1　HPLC chromatograms of reference substances（A）、sam p Ie（B）and b Iank（C）

2.2供試品溶液的制備 取五味子藥材粉末（過60目篩）約1.00 g，精密稱定，置離心管中，加入甲醇12 mL，冰浴超聲提取，每次25 min，共提取4次，合并提取液，離心，過濾，至50 mL量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，過0.45μm濾膜，取續濾液作為供試品溶液。

2.3對照品溶液的制備 精密稱取5-HMF對照品6.07 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻。從中精密吸取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得，4℃儲藏備用。

2.4線性關系的考察 精密量取對照品貯備液，分別稀釋2、4、8、10、16、32倍，分別進樣10 μL，按照“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得對照品的標準曲線，線性回歸方程為A= 55 810C+1.092 1，r=0.999 9，5-HMF在1.14～18.21μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5精密度試驗 精密吸取對照品溶液按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，進樣量10μL，測定5-HMF的峰面積。測得5-HMF峰面積的RSD為0.2%。結果表明儀器的精密度良好。

2.6穩定性試驗 取新制的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h按“2.1”項下色譜條件進行色譜分析。測得5-HMF峰面積的RSD為1.0%。結果表明樣品在10 h內穩定性良好。

2.7重復性試驗 分別精密稱取樣品（批號20081001）6份，分別按“2.2”項下供試品制備方法和“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。測得5-HMF平均含有量為0.161 8mg/g，RSD為2.0%，表明該方法重復性良好。

2.8加樣回收率試驗 精密稱取9份已知含有量的五味子藥材粉末（批號20081001），每份0.50 g，精密稱定，根據其含有量的80%、100%、120%分別加入對照品貯備液1.8、2.2、2.7 mL，平行3份，按照“2.2”項下方法制備，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率和RSD值。結果表明其平均加樣回收率為100.1%，RSD為1.0%。具體結果見表1。

表1　5-HMF加樣回收率試驗結果Tab.1 Resu Its of recovery tests for 5-HMF

2.9檢測限與定量限 在選定的色譜條件下，精密量取5-HMF對照品溶液適量，逐級稀釋進樣。最終確定檢測限為0.04 ng（S/N=3），定量限為2.85 ng（S/N≥10）。

2.10樣品測定 分別按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積代入回歸方程中計算5-HMF的量，結果見表2。

五味子鮮果和五味子干燥種子中未檢出5-羥甲基糠醛，五味子干燥果實和干燥果肉中均含有5-羥甲基糠醛，且干燥果肉中5-羥甲基糠醛含有量較高。檢測了2008—2013年的12批五味子干燥果實樣品，其含有量差異較大，范圍為0.09～2.40 mg/g。

表2　五味子不同部位及不同批號樣品中5-HM F測定結果（n=3）Tab.2 Content of 5-HMF in different parts and batches of Schisandra chinensis（n=3）

3　討論

3.1檢測波長的確定 采用PDA檢測器對5-HMF進行掃描，結果顯示5-HMF在284 nm有最大吸收波長，所以本實驗選擇284 nm作為測定波長。另外，本實驗采用PDA檢測器對樣品和對照品進行了峰純度驗證，結果表明在本實驗所確定的檢測條件下，5-HMF峰不含其他干擾成分。

3.2提取方法的選擇 5-HMF的生成與溫度密切相關，溫度較高可能導致或加速美拉德反應的發生［5-6，12］，所以沒有考慮熱提取的方法以避免加熱過程產生影響。本實驗考察了冰浴超聲提取法與冰浴振搖提取法，結果表明兩種方法相差不大，考慮到超聲提取法操作簡單故確定了本實驗樣品制備方法。

3.3提取溶劑用量，提取時間，提取次數的選擇通過單因素試驗和正交試驗最終確定溶劑用量為12倍甲醇，冰浴超聲提取4次，每次25 min。由于本實驗超聲提取時間較長，為了驗證5-HMF在提取條件下是否發生變化，將定容搖勻后的提取液，分別超聲0、30、60、90、120、150 min，測定，其RSD為0.5%，說明在本實驗超聲提取過程中5-HMF未發生變化。

3.4色譜條件的選擇 選用了不同比例的甲醇-0.5%醋酸水，結果發現比例為15∶85，10∶90和5∶95時5-HMF的分離效果和峰形沒有明顯區別，但是后兩者保留時間較長，為了節省分析時間，所以選擇甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）為流動相。選擇了不同牌子的色譜柱XAqua C18（4.6 mm×250 mm，10μm），Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5μm）和Waters symmrtry C18（4.6 mm×250 mm， 5μm），發現Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）峰形最好，所以選用Diamonsi1C18（2）色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）。

3.5本實驗分別用水、甲醇、不同體積分數的乙醇、乙酸乙酯冰浴超聲提取五味子新鮮果實1 h，以及用水冷浸24 h后再冰浴超聲提取1 h，均未檢出5-HMF，說明5-HMF并不是在五味子生長過程中產生的。對五味子干燥全果、果肉、種子的檢測發現種子中未檢出5-HMF，干燥后的果實和果肉中均檢出5-HMF，且果肉中5-HMF含有量較高，說明五味子藥材中的5-HMF主要來源于果肉部分，可能是由五味子果肉中的糖在加熱烘干的過程中產生，這有利于研究五味子中5-HMF的產生機理。不同批號的五味子藥材中5-HMF的含有量差異較大，可能是由于加工干制的過程中烘干時間和溫度等條件不統一，這說明對五味子藥材中5-HMF建立合適的限度標準，從而對規范五味子的加工干制過程和提高五味子藥材的質量具有重要意義。

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Determ ination of 5-hydroxmethy IfurfuraI in Schisandra Chinensis Fructus by HPLC-UV

LIYue1， AN Kai-1ong2， LIDe-kun3， YANG Yue-wu3， YU Bo-yang1， JU Ai-chun3*
（1.China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；3.Tianjin Tasly Pride Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining 5-hydroxymethy1furfura1 in Schisandra Chinensis Fructus.METHOD The HPLC ana1ysiswas performed on a Diamonsi1C18（2）co1umn（4.6mm×250 mm，5 μm）and themobi1e phase consisted ofmethano1-0.5%acetic acid（15∶85）at a f1ow rate of 1.0 mL/min.The detection wave1ength was setat284 nm and the co1umn temperaturewasmaintained at30℃.RESULTS The 1inear range of 5-hydroxmethy1furfura1was in the range of 1.14-18.21μg/mL（r=0.999 9），average recovery was 100.1%，and RSD was 1.0%.5-HMF was undetected in fresh and dried seeds of S.chinensis Fructus，but their dried pu1ps presented the higher content.5-HMF content in 12 batches of S.chinensis Fructus was in the range of 0.086 1-2.395 8 mg/g.CONCLUSION The 5-HMF is produced in the process of heating dried of fresh pu1ps of Schisandra chinensis Fructus.5-HMF content ismain1y stemmed from the hot-processing pu1p of S.chinensis.There are significant differences of 5-hydroxmethy1furfura1 in Schisandra chinensis Fructus among different batches.

Schisandra chinensis Fructus；5-hydroxymethy1furfura1；HPLC-UV

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0142-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.029

2014-03-01

李 越（1989—），女，碩士生，主要從事中藥質量控制研究。Te1：（022）26736121，E-mai1：1iyuehappy@163.com

鞠愛春（1973—），男，副高級工程師，主要從事中藥注射劑工藝及質量控制方向的研究。E-mai1：juach@tas1y.com