馬錢子減毒總生物堿的制備及毒性

王冬月，　陳 軍，　董 潔，　陸姍姍，　蔡寶昌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　南京　210023；2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇　南京　210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇　南京　210023；4.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點研究實驗室，江蘇　南京　210023；5.南京海昌中藥集團(tuán)，江蘇　南京　210061）

馬錢子減毒總生物堿的制備及毒性

王冬月1，2，3，4，5，陳 軍1，2，3，4，董 潔1，陸姍姍1，蔡寶昌2，3，4，5*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇南京210023；4.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點研究實驗室，江蘇南京210023；5.南京海昌中藥集團(tuán)，江蘇南京210061）

目的 制備去除大部分士的寧的馬錢子減毒總生物堿，并考察馬錢子總生物堿減毒前后成分及毒性的變化。方法 用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解馬錢子總生物堿，經(jīng)磁力攪拌、離心后制備得到馬錢子減毒總生物堿，HPLC法測定馬錢子減毒總生物堿中馬錢子堿和士的寧的量。用Q-TOF-MS技術(shù)比較鑒定了馬錢子總生物堿減毒前后的主要生物堿類成分。通過小鼠口服急性毒性試驗考察了馬錢子總生物堿減毒前后的毒性變化情況。結(jié)果 以20%乙醇為溶劑制備的馬錢子減毒總生物堿去士的寧效果最好，同時不影響其他19種生物堿類含有量。小鼠口服急性毒性LD50實驗表明馬錢子減毒總生物堿與馬錢子總生物堿的LD50分別為31.08 mg/kg、10.92 mg/kg。結(jié)論 馬錢子總生物堿中士的寧占38.49%，減毒后僅占14%，減毒工藝提高了馬錢子總生物堿臨床使用的安全性。

馬錢子總生物堿；馬錢子減毒總生物堿；乙醇；HPLC；LC-MS/MS；急性毒性試驗

馬錢子又名番木鱉，為馬錢子科植物馬錢Strychons nuxvomica L.的干燥成熟種子。具有通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫之功效［1］。馬錢子的主要有效且有毒部位是總生物堿，馬錢子堿與士的寧占其絕大部分，而馬錢子堿的毒性是士的寧的1/20～1/40［2］。文獻(xiàn)表明，士的寧在鎮(zhèn)痛［3-4］及抗炎、治療風(fēng)濕方面無效［5］。而馬錢子總生物堿卻有明顯的效果。因此設(shè)想如能去除馬錢子總生物堿中的士的寧，就可以在保留藥效的基礎(chǔ)上降低毒性，提高臨床用藥的安全性。本實驗利用馬錢子總生物堿溶于20%乙醇時，其中的馬錢子堿與士的寧溶解度相差最大的機(jī)制，經(jīng)磁力攪拌、離心后去除馬錢子總生物堿中的士的寧，得到馬錢子減毒總生物堿。并采用Q-TOF-MS技術(shù)對馬錢子總生物堿與馬錢子減毒總生物堿中的生物堿類成分進(jìn)行分析，最終通過小鼠口服急性毒性試驗比較兩者的毒性。

1　材料

1.1藥品與試劑 制馬錢子（批號20110517），浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為馬錢子科植物馬錢Strychons nuxvomica L.的干燥成熟種子；馬錢子堿、士的寧（美國Sigma公司）。庚烷磺酸鈉（山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠，批號2009041503）；磷酸二氫鉀（上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號20030801）；質(zhì)譜純乙腈（德國Merck公司）；其余試劑皆為分析純。

1.2儀器 LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司），UFLC/Q-TOF-MS（LC-MS-Trip1e TOFTM5600+，AB SCIEX，美國），TGL-20bR高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），BT25S電子天平（德國Sartorius公司），PHS-3C PH計（上海康儀儀器有限公司），TK-12D透皮擴(kuò)散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），DZF-6020真空干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），KH-100DE超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3動物 ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，南通大學(xué)動物實驗中心提供。合格證號：SCXK（蘇）2008-0010。

2　方法與結(jié)果

2.1馬錢子總生物堿的制備 馬錢子堿及士的寧分別在制馬錢子中占1.04%（n=5）、1.68%（n= 5），符合《中國藥典》規(guī)定。精密稱取200 g制馬錢子粉末（過50目篩），用15倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次0.5 h，過濾，合并3次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。得到馬錢子總生物堿粗提物，得率為17.13%（n=3）。用1 mo1/L的鹽酸20 mL超聲溶解，4 000 r/min離心10 min，取上清液，40%的氫氧化鈉調(diào)pH至12.0。用二氯甲烷萃取合并，真空干燥除去二氯甲烷，得到馬錢子總生物堿，精密稱定質(zhì)量，得率為（2.74±0.31）%（n=5）。用酸性染料比色法［6］測得馬錢子總生物堿的純度為（以馬錢子堿計）（98.93±0.002）%（n=3）。

2.2馬錢子減毒總生物堿制備工藝考察

2.2.1色譜條件［1］Purospher STAR RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-［0.01 mo1/L庚烷磺酸鈉-0.02 mo1/L磷酸二氫鉀等量混合（用10%磷酸調(diào)pH至2.8）］（21∶79）；體積流量0.8 mL/min；檢測波長264 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取馬錢子堿、士的寧對照品10 mg，用甲醇溶解、稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的馬錢子堿和士的寧對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱定馬錢子減毒總生物堿固體物10 mg，用甲醇溶解、稀釋，得到質(zhì)量濃度為32μg/mL的供試品溶液。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取一定體積的馬錢子堿和士的寧對照品溶液，用甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0.52、1.04、2.08、4.16、8.32、16.64μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC進(jìn)樣，得到峰面積。以質(zhì)量濃度（Ⅹ）對峰面積（Y）作線性回歸，分別得到馬錢子堿和士的寧的回歸方程。馬錢子堿的回歸方程為Y=21 483Ⅹ+3 447.6（r=0.999 9）；士的寧的回歸方程為Y=25 460Ⅹ+2 128.5（r= 0.999 9），馬錢子堿與士的寧質(zhì)量濃度在0.52～16.64μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5馬錢子總生物堿的測定 精密稱定馬錢子總生物堿固體物20 mg，用甲醇溶解、稀釋，得到質(zhì)量濃度為32μg/mL的供試品溶液。HPLC法測定其中馬錢子堿和士的寧的量，馬錢子堿占馬錢子總生物堿的21.80%，士的寧占馬錢子總生物堿的38.49%（n=3）。

2.2.6乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 精密稱取5份1 g的馬錢子總生物堿粉末，依次放入裝有1 mL 10%、20%、30%、40%、50%乙醇的西林瓶中。30℃超聲5 min（功率600 W，頻率40 kHz）。封口膜密封，于30℃水浴下磁力攪拌（500 r/min）12 h。分別將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min高速離心3 min，吸取上清液。并置65℃真空干燥箱中干燥12 h，得固體物，即馬錢子減毒總生物堿，精密稱定并計算固體物得率。精密稱取一定量的馬錢子減毒總生物堿固體物，甲醇定容并稀釋。HPLC測定其中馬錢子堿和士的寧的量。測定結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可知，用20%乙醇溶解馬錢子總生物堿，其中的馬錢子堿和士的寧的溶解度相差最大，制得馬錢子減毒總生物堿，其中的馬錢子堿和士的寧的含有量相差最大。

表1　不同體積分?jǐn)?shù)乙醇制備得到的馬錢子減毒總生物堿，其中馬錢子堿與士的寧的量（±s，n=3）Tab.1 Content of brucine and strychnine in MTAF under different concentrations of ethanoI（±s，n=3）

乙醇體積分?jǐn)?shù)/%固體物得率/%馬錢子堿/（μg·mL-1）士的寧/（μg·mL-1）馬錢子堿/士的寧10 34.08 161.40 68.98 2.34±0.002 20 34.30 161.25 63.50 2.54±0.086 30 35.72 159.75 66.11 2.42±0.074 40 33.54 156.46 75.78 2.06±0.015 50 34.64 142.32 68.94 1.93±0.008

2.2.7馬錢子總生物堿的加入量考察 為考察除乙醇體積分?jǐn)?shù)外的其他因素對馬錢子減毒總生物堿中馬錢子堿和士的寧的影響，向確定的溶劑中加入不同量的馬錢子總生物堿。精密稱取0.125 g、0.25 g、0.5 g、1 g馬錢子總生物堿粉末，依次放入4個裝有1 mL 20%乙醇的西林瓶中。其余操作同“2.2.6”項下，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，其他條件相同時，在1 mL的20%乙醇中加入0.25 g馬錢子總生物堿，制得馬錢子減毒總生物堿，其中的馬錢子堿和士的寧含有量相差最大。

2.2.8放大工藝考察 為提高效率，適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)，考察了去士的寧工藝成比例放大的可行性。精密稱取0.25 g、0.5 g、1 g、2 g馬錢子總生物堿粉末，依次放入裝有20%乙醇1 mL、2 mL、4 mL、8 mL的西林瓶中。其余操作同“2.2.6”項下，結(jié)果見表3。由表3可知，將去士的寧規(guī)模放大，即將2 g馬錢子總生物堿加入8 mL 20%的乙醇中得到的馬錢子減毒總生物堿，其中的馬錢子堿和士的寧含有量相差最大。

表2　馬錢子總生物堿不同加入量，制備得到馬錢子減毒總生物堿，其中馬錢子堿和士的寧的量（±s，n=3）Tab.2 Content of brucine and strychnine in MTAF under different added amount of TAF（±s，n=3）

表2　馬錢子總生物堿不同加入量，制備得到馬錢子減毒總生物堿，其中馬錢子堿和士的寧的量（±s，n=3）Tab.2 Content of brucine and strychnine in MTAF under different added amount of TAF（±s，n=3）

馬錢子總生物堿加入量/g固體物得率/ %馬錢子堿/（μg·mL-1）士的寧/（μg·mL-1）馬錢子堿/士的寧（±s）0.125 28.50 152.26 56.87 2.68±0.028 0.25 34.30 156.61 56.79 2.76±0.043 0.5 32.16 154.99 56.32 2.75±0.042 1 34.30 162.48 63.72 2.55±0.013

表3　不同規(guī)模的工藝，制得馬錢子減毒總生物堿，其中馬錢子堿和士的寧的量（±s，n=3）Tab.3 Content of brucine and strychnine in MTAF under different scaIe（±s，n=3）

表3　不同規(guī)模的工藝，制得馬錢子減毒總生物堿，其中馬錢子堿和士的寧的量（±s，n=3）Tab.3 Content of brucine and strychnine in MTAF under different scaIe（±s，n=3）

馬錢子總生物堿加入量/g溶劑體積/m L固體物得率/%馬錢子堿/（μg·mL-1）士的寧/（μg·mL-1）馬錢子堿/士的寧0.25 1 34.30 149.31 58.89 2.53±0.061 0.5 2 36.90 154.47 56.82 2.72±0.006 1 4 38.26 154.16 55.00 2.80±0.009 2 8 38.59 147.69 47.38 3.12±0.020

2.2.9結(jié)果 根據(jù)上述結(jié)果，馬錢子減毒總生物堿的制備工藝可以確定為：將2 g馬錢子總生物堿加入裝有8 mL 20%乙醇的西林瓶中，30℃超聲5 min。封口膜密封，于30℃水浴下磁力攪拌（500 r/min）12 h。分別將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min高速離心3 min，吸取上清液。置65℃真空干燥箱中干燥12 h，所得固體物即馬錢子減毒總生物堿，得率約38.59%（n=3）。馬錢子減毒總生物堿中馬錢子堿與士的寧的含有量比可以達(dá)到約3.12∶1（n=3）。

2.3馬錢子總生物堿減毒前后的成分分析

2.3.1色譜條件 Agi1ent ZORBAX Ec1ipse P1us C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5μm）；柱溫30℃；流動相為0.3%甲酸水溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～20%B；5～13 min，20%～25%B；13～25 min，25%～50%B）；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量1μL。

2.3.2質(zhì)譜條件 采用ESI離子源；在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍：m/z100～800。各項參數(shù)設(shè)置：霧化氣（Gas 1）55 Pa；輔助氣（Gas 2）55 Pa；氣簾氣（CUR）35 Pa；離子源溫度（TEM）550℃；噴霧電壓（SVF）5 500 eV；去簇電壓（DP）60 eV；碰撞電壓（CE）50 eV；碰撞電壓差（CES）15 eV。樣品進(jìn)樣之前進(jìn)行分子量校正。實驗數(shù)據(jù)采用Peakview軟件（1.2）處理。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱取馬錢子總生物堿及馬錢子減毒總生物堿粉末各10 mg，用甲醇溶解并稀釋，得到質(zhì)量濃度為40μg/mL的馬錢子總生物堿、馬錢子減毒總生物堿的供試品溶液。進(jìn)樣前經(jīng)0.22μm濾膜濾過。

2.3.4結(jié)果 利用UFLC/Q-TOF-MS得到減毒前后馬錢子總生物堿中各生物堿類成分的母離子及碎片離子的精確質(zhì)量信息，結(jié)合文獻(xiàn)［7-11］，對馬錢子總生物堿及馬錢子減毒總生物堿中的生物堿成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)推測。圖1為馬錢子總生物堿溶液及馬錢子減毒總生物堿溶液總離子流圖，圖2～圖4為馬錢子減毒總生物堿中主要成分的MS2圖及推測裂解途徑舉例。馬錢子堿總生物堿減毒前后檢測到19種相同的生物堿類成分，見表4。

圖1　馬錢子總生物堿溶液（A）與馬錢子減毒總生物堿溶液（B）正離子模式下的總離子流圖Fig.1　Representative chromatogram s for the totaIaIkaIoid fraction from nux-vom ica and themodified totaIaI-kaIoid fraction in positive ion mode

圖2　馬錢子堿的MS2圖及裂解途徑Fig.2　MS2spectra and proposed fragmentation of brucine

圖3　士的寧的MS2圖及裂解途徑Fig.3　MS2spectra and proposed fragmentation of strychnine

圖4　偽番木鱉堿的MS2圖及裂解途徑Fig.4　MS2spectra and proposed fragmentation of pseudostrychnine

表4　馬錢子總生物堿及馬錢子減毒總生物堿溶液Q-TOF-MS數(shù)據(jù)及成分鑒定Tab.4 Identification resu Its of TAF and M TAF by Q-TOF-MS

2.4 馬錢子總生物堿與馬錢子減毒總生物堿口服極性毒性試驗 對馬錢子總生物堿和馬錢子減毒總生物堿進(jìn)行小鼠口服急性毒性試驗研究。通過試驗可以了解兩者的毒性程度，預(yù)測藥物的安全性。

2.4.1溶液的配制 取馬錢子總生物堿、馬錢子減毒總生物堿適量，精密稱定，置量瓶中，用PBS溶解。

2.4.2實驗方法 經(jīng)過預(yù)試驗后得到馬錢子總生物堿、馬錢子減毒總生物堿溶液的Dn（0%致死量）與Dm（100%致死量）。兩組藥均選擇4個劑量，用“低比稀釋法”配置藥液。實驗選用ICR小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。將兩種藥分別分成4組，每組10只動物。實驗前禁食12 h（不禁水）。按每10 g體質(zhì)量0.2 mL劑量給小鼠灌胃。實驗結(jié)束后用“改良寇式法”計算小鼠的半數(shù)致死量LD50及其95%可信限。最終計算得馬錢子總生物堿的LD50為10.92 mg/kg，LD50的95%可信限為10.91～13.35mg/kg。馬錢子減毒總生物堿的LD50為31.08 mg/kg，LD50的95%可信限為23.56～38.56 mg/kg。

3　討論

通過考察，確定了馬錢子總生物堿減毒（去士的寧）的最優(yōu)工藝。即以20%乙醇為溶劑，將一定量的馬錢子總生物堿，經(jīng)磁力攪拌、離心及干燥后制備得到馬錢子減毒總生物堿。馬錢子生物堿中士的寧占38.49%，馬錢子堿占21.80%。去士的寧后馬錢子減毒總生物堿中士的寧占14%，馬錢子堿占42.91%。士的寧的比例相對提高，證明去除了絕大部分的士的寧。利用先進(jìn)的分析儀器LC-MS-Trip1e TOFTM5600+分析馬錢子總生物堿和馬錢子減毒總生物堿，推測鑒定得到19種相同的生物堿類成分。小鼠的口服急性毒性試驗揭示了馬錢子總生物堿及馬錢子減毒總生物堿均有毒性，而馬錢子減毒總生物堿的毒性較馬錢子總生物堿的毒性下降了約3倍?？梢姡康膶幨邱R錢子總生物堿中的主要毒性成分。證明了馬錢子總生物堿的減毒（去士的寧）工藝在去除了絕大部分毒性成分的同時，確保主要的成分組成不發(fā)生變化。

必須指出的是，此前，采用50%乙醇為溶劑從馬錢子堿總生物堿中去除士的寧，其依據(jù)是馬錢子堿與士的寧單體在50%乙醇中的溶解度相差最大［12］。但是，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這兩種成分在總生物堿中的溶解度與單體時完全不同，因此本實驗采用測定其在總生物堿中的溶解度來確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

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Preparation and toxicity of Iow-strychnine totaIaIkaIoids from Strychni Semen

WANG Dong-yue1，2，3，4，5， CHEN Jun1，2，3，4， DONG Jie1， LU Shan-shan1， CAIBao-chang2，3，4，5
（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China；3.Engineering Center for Standardization of ChineseMedicine Processing，Ministry of Education，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；4.Key laboratory for Standardization ofChineseMedicine Processing，State Administration of Traditional ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；5.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Corporation，Nanjing 210061，China）

AIM To prepare the 1ow-strychnine tota1a1ka1oids from Strychni Semen and to ana1yze the changes of their chemica1 constituents and toxicity.METHODS Different concentrations of ethano1so1ution as extraction so1vents，magnetic stir and centrifuga1separation were used to attenuate the strychnine content.The determination of brucine and strychninewas performed by HPLC，and Q-TOF-MSsystem was app1ied to the identification of other a1ka1oids.At the same time，the toxicity changes before and after attenuation were exp1ored by use of acute toxicity experiment ofmice.RESULTS 20%ethano1 did the best to 1ower strychnine content and did no harm to the contents of other nineteen constituents.The acute toxicity data showed that the LD50ratio ofwithout attenuation and

tota1a1ka1oids from Strychni Semen；1ow-strychnine tota1a1ka1oids from Strychni Semen；ethano1；HPLC；LC-MS/MS；acute toxicity

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0168-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.036

2013-12-21

王冬月（1987—），女，碩士，研究方向：中藥新劑型與藥物動力學(xué)。E-mai1：wangdongyue19871208@126.com

蔡寶昌（1952—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥炮制規(guī)范化與標(biāo)準(zhǔn)。Te1：（025）85811112，E-mai1：bccai@126.com

with attenuation was 31.08 mg/kg vs 10.92 mg/kg.CONCLUSION Attenuation can effective1y make the remova1of strychnine from 38.49%to 14%and guarantee the c1inic security of Strychni Semen.