基因組編輯技術研究進展及其在植物中的應用

徐華山等

摘 要：基因組編輯技術是進行農(nóng)作物基因功能研究和遺傳改良的重要輔助工具，目前已經(jīng)成熟應用的基因組編輯技術包括ZFNs、TALENs以及近幾年興起的CRISPR/Cas系統(tǒng)。該文介紹了ZFNs、TALENs及CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進展、各自的優(yōu)缺點以及在植物中的應用，并對基因組編輯技術的應用前景進行了展望。

關鍵詞：基因組編輯；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas；植物

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-15-05

隨著現(xiàn)代分子生物學的飛速發(fā)展，越來越多的物種基因組測序完成，研究基因功能成為了科學家下一步的工作重心。基因組編輯技術被《Science》評為2012年十大重要科學進展之一，利用基因組編輯技術對植物基因進行改造是進行農(nóng)作物遺傳改良的重要輔助手段。目前應用最多的基因組編輯技術主要包括鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[1-2]，類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like nucleases，TALENs）[3-4]以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)[5]。ZFNs是第一種由人工改造應用的核酸內切酶，由含有鋅指結構域的轉錄因子和非特異性的核酸內切酶Fok I 的切割結構域融合而成。盡管ZFNs成功應用于多種生物的基因組編輯，但是設計困難、組裝昂貴、耗時長、失敗概率高等缺點限制了該技術的發(fā)展與應用。TALENs是利用類轉錄激活因子效應物DNA結合結構域和非特異性的核酸內切酶Fok I 的切割結構域融合而成的核酸內切酶。TALENs實現(xiàn)了單個蛋白質與單個核苷酸的對應，與ZFNs相比更易組裝設計，打靶效率也更高[6-8]。2013年初，基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)改造的由RNA介導的全新人工核酸酶CRISPR/Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)了，與ZFNs和TALENs相比，該系統(tǒng)只需設計和目標核苷酸對應的RNA序列即可，操作手段更簡單，效率更高，成本更低，適合普通分子生物學實驗室操作，為基因組編輯提供了新的平臺。本文就3種基因組編輯技術的作用原理、結構特征及使用特點等方面進行介紹，并對基因組編輯技術在植物基因編輯中的應用進行了展望。

1 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)的原理及特點

1.1 ZFNs技術 鋅指核酸酶（ZFNs）是應用較早的一類基因組編輯技術。該酶的N端是鋅指蛋白DNA結合域，可以識別并結合含特定堿基序列的DNA，C端是非特異性核酸酶Fok I的切割結構域。鋅指蛋白根據(jù)保守結構域的不同可以分為C2H2型、C4型和C6型，研究應用比較多的是C2H2型。這種鋅指蛋白由30個氨基酸構成并圍繞鋅離子折疊成ββα結構，α螺旋插入DNA雙螺旋中可以特異識別DNA序列上的3個連續(xù)堿基并與之結合[9-10]。

人工合成的鋅指核酸酶由可以特異性識別DNA序列的鋅指蛋白和非特異性的核酸內切酶FokI組成。鋅指蛋白結構域通常含有3～4個鋅指結構，每個鋅指結構可以特異性識別DNA上的3個連續(xù)堿基，因此每個鋅指核酸酶通常可以特異性識別9～12bp的DNA序列。鋅指核酸酶與靶DNA結合后，F(xiàn)okI便在結合位點進行剪切造成DNA斷裂。如果切割時存在同源序列，則會發(fā)生DNA同源重組修復（HR），不存在同源序列時則以非同源末端連接（NHEJ）的方式進行DNA修復，造成基因缺失、突變或堿基插入[11-12]。目前鋅指蛋白的設計和篩選方法主要有以下幾種：一是利用Sangamo Biosciences公司的專利設計鋅指核酸酶，該方法效率高，特異性強，可以商業(yè)化訂制，但是價格比較昂貴。二是利用開放平臺Oligomerized Pool Engineering（OPEN）設計鋅指核酸酶，該方法免費向公眾開放，但是構建過程需2～3個月，費時費力。后來Joung等又開發(fā)了上下文依賴組裝（context-dependent assembly，CoDA）方法，可以在網(wǎng)站（http：//www.zincfingers.org/）上直接設計構建，但是報道顯示該方法的成功率并不太高[13]。

1.2 TALENs技術 隨著重復可變雙殘基（repeat variable di-residues，RVDs）與核苷酸對應關系的破解，類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like nucleases，TALENs）的研究與應用進入快速發(fā)展階段，成為新的主流基因組編輯工具[6]。

與ZFNs類似，TALENs也由特異性蛋白與非特異性核酸酶FokI2個部分組成，特異性蛋白負責識別目標DNA序列并引導FokI對DNA進行切割，造成DNA斷裂，斷裂的DNA通過HR或NHEJ機制進行修復。TALE蛋白來源于黃單胞桿菌Xanthomonas，這是一種對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有較大危害的植物病原菌。TALE蛋白的N端含有III型分泌信號肽，C端包含核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）以及轉錄激活結構域（Activation domain，AD），中間是決定特異性的DNA識別結合結構域[14]。DNA識別結合結構域由多個重復氨基酸單元串聯(lián)組成，每個單元含有34個氨基酸。每個重復單元的氨基酸序列幾乎一致，僅第12和13位可變，這2個可變氨基酸殘基稱為重復可變雙殘基（repeat variable di-residues，RVDs），每個重復單元可識別結合1個核苷酸，特異性就由RVDs決定。研究發(fā)現(xiàn)共有4種RVDs，每種RVDs特異識別結合1種核苷酸，其中NI（天冬酰胺和亮氨酸）識別堿基A，NN（2個天冬酰胺）識別堿基G或A，NG（天冬酰胺和甘氨酸）識別堿基T，HD（組氨酸和天冬氨酸）識別堿基C。因此RVDs的類型、數(shù)目及順序決定了TALENs識別DNA序列的特異性[15-16]。由于RVDs與核苷酸對應關系比較簡單，每個RVDs特異識別結合1種核苷酸，因此與ZFNs相比，TALENs的可作用靶位點十分廣泛。每個TALENs大約包含20個左右的重復單元，組裝過程比較復雜，目前其組裝方法主要有以下3種：標準的限制性酶切和連接組裝法、Golden Gate組裝法及固相組裝法[17]。Golden Gate組裝法花費少、構建周期短、工作量小，是目前應用最為廣泛的組裝方法，該方法利用IIS型核酸酶創(chuàng)造多粘性末端，一次反應即可輕松連接多達10個重復單元。目前TALENs技術已經(jīng)在多種植物如煙草、水稻、短柄草及擬南芥中得到廣泛應用。

1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng) 繼ZFNs和TALENs之后，針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究與應用逐漸增多。與ZFNs和TALENs相比，作為后起之秀的CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯方面載體構建簡單，花費更少，技術難度也更低。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）是指成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列，Cas（CRISPR associated）是指與CRISPR 相關的蛋白。CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas蛋白組成，其中CRISPR序列由一些高度保守的重復序列和間隔序列相間排列組成，Cas蛋白是CRISPR序列附近相關基因編碼的蛋白酶，具有核酸酶活性，可對DNA序列進行切割，造成DNA雙鏈斷裂[18]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌自身的一套免疫系統(tǒng)。當噬菌體或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系統(tǒng)識別外源DNA中特定的前間隔序列（protospacer）和前間隔序列鄰近序列（protospacer adjacent motifs，PAMs）。宿主將這一新的間隔序列整合進入CRISPR 系統(tǒng)，插入在前導序列和原先第一個重復序列之間。當同一噬菌體或病毒再次侵染時，CRISPR 序列在前導序列引導下轉錄出前crRNA，前crRNA 接著被加工成小crRNA。這些crRNA 與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）形成一種復合RNA結構。復合RNA結構識別外源DNA中的spacer序列引導Cas蛋白復合體對外源DNA 序列進行切割，從而保護宿主免受侵害。RISPR/Cas系統(tǒng)共分3個類型，I型和III型均需多個Cas蛋白參與形成復合體，II型僅需Cas9蛋白即可，使用更方便，因此目前研究應用比較多的是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)[19-21]。

2012年，Jinek等[19]對II型CRISPR/Cas系統(tǒng)進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA整合成一條單一引導RNA（single-guide RNA，sg RNA）仍能高效引導Cas9蛋白對DNA進行切割。2013年，Cong等[20]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對人和小鼠細胞進行了內源基因的定點敲除。ZFNs和TALENs需構建不同的融合蛋白來識別不同的DNA序列，操作過程比較繁瑣，花費較大，CRISPR/Cas系統(tǒng)針對不同DNA序列只需設計不同的引導RNA即可，無需構建蛋白。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)在煙草、擬南芥、高粱、水稻和小麥等多種植物基因編輯中得到廣泛應用。

1.4 小結 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前應用最廣泛的基因組編輯工具，3種工具各具特點，研究者可根據(jù)具體情況選擇。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)作用原理見圖1，特點比較見表1。

2 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因編輯中的應用

2.1 ZFNs在植物基因編輯中的應用 ZFNs最初主要通過轉化或胚胎注射的方式導入到酵母或動物胚胎細胞中，在細胞中表達進行基因編輯。在植物方面，Wright等[22]在2005年構建了融合GUS：NPT II基因（缺失600個堿基）的煙草原生質體，然后利用電穿孔法將能識別GUS：NPT II基因序列的ZFNs及供體DNA（600個堿基）共同導入原生質體中，結果10%以上的原生質體發(fā)生了同源重組，其中20%的GUS：NPT II基因經(jīng)同源重組得到修復。該研究證明了ZFNs在植物基因編輯中應用的可能性。ZFNs在植物應用中的真正突破是2008年Maeder等[13]利用ZFNs技術將煙草中乙酰乳合酶基因SuRA敲除。2009年，Shukla等[23]利用ZFNs技術將抗除草劑基因插入到玉米內源基因IPK中，在獲得的600個抗除草劑愈傷組織中檢測到了預期的變異。2013年，Curtin等[24]利用根毛轉化系統(tǒng)研究ZFNs技術對大豆基因組9個基因的誘變作用，發(fā)現(xiàn)7個基因發(fā)生變異。作為多倍體物種，大豆的基因組高度重復，該研究表明ZFNs技術也可以用于高度重復基因組的基因編輯工作。

2.2 TALENs在植物基因編輯中的應用 與ZFNs相比，TALENs在模塊構建與成本花費方面都有優(yōu)勢，在植物中的應用也更廣泛。Cermak等[25]于2011年用Golden Gate組裝法構建TALENs模塊，在擬南芥原生質體中敲除ADH1基因，該研究表明TALENs在植物細胞內具有定點突變的功能。Li等[26]于2012年利用TALENs技術破壞了水稻感病基因Os11N3的啟動子序列，提高了水稻的抗病能力。2013年，Zhang等[27]利用TALENs技術編輯煙草SurA和SurB基因，他們將TALENs載體和供體DNA導入煙草原生質體，在4%的愈傷組織中檢測到了供體DNA 的標記。Shan等[3]2013年利用TALENs技術對水稻和短柄草中的12個位點進行定點突變，突變頻率為3.8%～100%。2015年，Shan等[28]利用TALENs技術編輯水稻OsBADH2、OsCKX2以及OsDEP1基因，突變率分別為9.7%、25.6%和9.2%，其中同時包含3個基因突變的植株為1.9%。以上研究表明TALENs技術在植物單基因突變和多基因突變方面都有較高的編輯效率。

2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因編輯中的應用 與ZFNs和TALENs技術相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)載體構建更為簡單，Cas9基因是相同的，針對不同的靶基因只需設計sgRNA而不需要設計組裝核酸酶，因此近幾年針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究與應用迅速增多。2013年，Shan等[29]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)定點突變了小麥的1個基因和水稻的4個基因，并且在T0代獲得了水稻PDS基因功能缺失的純和突變體，該突變體呈現(xiàn)預期的白化和矮小。Li等[30]2013年利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在擬南芥和本生煙中實現(xiàn)了基因定點突變并通過同源重組修復方式在煙草PDS基因的特定位點插入一個6bp的限制性酶切位點。Feng等[31]于2013年利用CRISPR/Cas系統(tǒng)分別對擬南芥和水稻進行了基因組定點突變，利用不同啟動子表達在擬南芥和水稻中表達Cas9基因和gRNA，結果表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以精確產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂及較高的突變效率（5%～84%），并且在T1代獲得了純和突變體。Miao等[32]于2013年采用玉米Ubi啟動子在水稻中表達Cas9蛋白，成功地對水稻葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角控制基因LAZY進行了靶向修飾，突變頻率分別為83.3%和91.6%。2014年，F(xiàn)eng等[33]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對擬南芥7個基因的12個靶位點進行修飾，T1代突變效率為30%～92%，T2代中單突變植株的后代有約22%為純合體，所有純合體均能穩(wěn)定遺傳至下一代。同年，Zhang等[34]對2個水稻亞種11個靶基因的研究顯示CRISPR/Cas系統(tǒng)在水稻中的編輯效率也是比較高的，約50%的基因編輯在胚性細胞第一次分裂前就已完成，后代檢測發(fā)現(xiàn)突變位點可以穩(wěn)定遺傳且符合經(jīng)典孟德爾遺傳規(guī)律。2015年，Xu等[35]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)定點突變了水稻AOX1家族的3個基因（AOX1a，AOX1b，AOX1c），靶基因突變可在后代穩(wěn)定遺傳，而且通過精心選擇作用位點可顯著降低脫靶率。

3 展望

ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)，使基因組編輯工作取得了飛速進展。ZFNs和TALENs出現(xiàn)早，使用時間長，但在具體的使用過程中技術難度較大、構建組裝時間較長，需要針對不同靶位點精心設計組裝蛋白分子，花費昂貴，難以大規(guī)模推廣應用。CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點是可以對任何NGG（PAM）前面的20bp序列進行編輯，能同時作用于多個靶位點，載體構建比較簡單[19]。

所有基因組編輯工具都有一個無法避免的問題，即對基因組非特異性位點切割造成的脫靶效應。理論上CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶率會高一些，而且CRISPR/Cas系統(tǒng)在不同物種中的脫靶率存在較大差異。目前利用各種方法降低CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶率，包括重新設計sgRNA以增強對靶DNA的親和力，根據(jù)不同的植物種類來優(yōu)化Cas蛋白的密碼子以增強其切割效率，尋找合適的靶位點增強CRISPR/Cas系統(tǒng)和靶DNA的轉一性。基因組編輯工具的脫靶效應對人類基因組編輯來說是不能容忍的，但是對植物基因組編輯來說并不是太大的問題，只是脫靶率高會增加后代鑒定篩選的工作量。新型基因組編輯工具在植物中的廣泛應用必將給植物育種帶來深遠的影響，通過基因組編輯工具產(chǎn)生的植物是否和傳統(tǒng)的轉基因植物同等對待，是對監(jiān)管部門的考驗。新技術還帶來了一些專利、倫理及法律方面的問題，將引發(fā)人們持續(xù)的思考與討論。

致謝：本研究由“973”計劃項目（“水稻優(yōu)良品種的分子設計研究”分子設計和多基因組裝研究，2013CBA1405）、“863”計劃項目（“水稻抗褐飛虱分子設計與高產(chǎn)、優(yōu)質抗褐飛虱水稻新品種培育”子課題，2012AA101101）和農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團隊項目“水稻分子與細胞工程育種”共同資助。

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