浙江東部泥鰍染色體倍性檢測與核型分析

王雨辰等

摘 要：采集浙江東部5地泥鰍群體樣本，利用流式細胞儀檢測泥鰍染色體倍體，使用光學顯微鏡分析其核型，為其種質分析提供參數；采用體內注射植物血凝素（PHA）和秋水仙素，提取頭腎組織，采用空氣干燥制片法制作泥鰍染色體標本。結果表明：浙江東部各水系的泥鰍均為二倍體，核型公式為2n=8m+6sm+36t，NF=64。

關鍵詞：泥鰍；染色體倍性；染色體核型；浙江東部

中圖分類號 S966.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-116-02

泥鰍隸屬鯉形目鰍科泥鰍屬，是廣泛分布于浙江省各水體的小型魚類，也是鰍科魚類中最有經濟價值的一種。經過近幾年的人工養殖，泥鰍市場愈發成熟，銷售量穩中有升；各地泥鰍親本來源也愈發復雜，各養殖場泥鰍親本混雜養殖規格差異較大。為了探索適合浙江省的泥鰍種質資源，筆者采集了浙江省多地的泥鰍野生群體進行倍性分析和核型檢測，為泥鰍進一步育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 2012年9～10月，在浙江省東部的桐鄉石門鎮、寧波澥浦、臨海汛橋、瑞安龍湖鎮和溫州鰲江采集泥鰍樣本。泥鰍全長122～198mm，體重7.04～37.96g。

1.2 實驗試劑 實驗試劑見表1。

表1 制作染色體標本藥品

[藥品名＼&純度＼&銷售商＼&氯化鈉（NaCl）＼&分析純＼&天津市廣成化學試劑有限公司＼&氯化鉀（KCl）＼&分析純＼&天津市廣成化學試劑有限公司＼&無水甲醇＼&≥99.9%＼&天津市廣成化學試劑有限公司＼&秋水仙素＼&95%＼&生興生物技術（南京）有限公司＼&乙酸＼&36%＼&國藥集團化學試劑有限公司＼&聚羥基脂肪酸脂（PHA）＼&＼&廣州醫藥工業研究所＼&Gimesa染液＼&＼&北京康倍斯科技有限公司＼&]

1.3 泥鰍暫養 將收集來的泥鰍經10mg·L-1的聚維酮碘浸泡30min后暫養于120L水箱中，日投喂沉性顆粒飼料20g。

1.4 倍性檢測 每個樣本按采集數量進行倍性檢測。將樣品采用100mg·L-1MS222麻醉后，用裝有抗凝劑的1mL注射器通過尾椎抽血的方法抽取泥鰍血液，通過PBS溶液稀釋至血細胞濃度為106個·mL-1，冰上保存待測。以實驗已確認的二倍體泥鰍血樣為內參，經DAPI染液染色，大鱗副泥鰍血樣∶待測組血樣∶DAPI=1∶1∶2，染色5min后，使用流式細胞儀（Cell Lab QuantaTMSC，Beckman Coulter）進行檢測。

1.5 染色體標本提取 從各群體中各取10尾泥鰍進行標本提取。參考國標方法進行實驗[1]。泥鰍按50μg·g-1劑量從腹腔注入植物血凝素（PHA）飼養于22～25℃45L的水箱中，24h后腹腔注射20μg·g-1秋水仙素，培養3h后，剪斷鰓部血管，將魚體倒掛，待血液不再流出后，解剖取頭腎。將頭腎置于裝有0.75%生理鹽水的1mL離心管中清洗，后取出頭腎轉入1mL離心管中滴入2滴0.75%生理鹽水，用研磨棒研磨過120目篩，取細胞懸液，轉入5mL離心管中，離心（3 000r/min）5min后，吸去液體，加入75mmol·L-1KCl溶液4mL，用移液槍吹打后靜置30min，離心（3 000r/min）5min后，加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）4mL，吹打均勻后靜置固定，然后離心（3 000r/min）重復3次。最后加入4mL固定液吹打均勻。用滴管吸取懸液，懸空滴在冷凍玻片上，酒精燈加熱烘干，Giemsa染色，待常溫干燥后，鏡檢。

1.6 核型分析 在顯微鏡油鏡視野中選取50個染色體中期分裂相進行染色體計數。染色體類型按照Levan等[2]的標準確定。數據用Excel和SPSS 18.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 倍性鑒定 經流式細胞儀檢測，采集到的泥鰍樣品均為二倍體，沒有發現四倍體（表2、圖1）。

2.2 染色體核型分析 在油鏡下選取分散良好、形態清晰的分裂相進行分析，選擇500個中期分裂相進行統計，見圖2。如圖2所示，染色體數目為50的分裂相占79.2%，占大多數。

由圖3可知，泥鰍的50對染色體中，中部著絲點染色體（m）4對，亞中部著絲點染色體（sm）3對，端部著絲點染色體（t）18對。組型公司為2n=8m+6sm+36t，臂數（NF）：64。對泥鰍染色體進行進一步分析，結果見表3。

3 結論

3.1 泥鰍的倍性 目前在我國已發現的泥鰍群體有二倍體、三倍體、四倍體和六倍體[3-6]，不同倍體的泥鰍混雜出現并無一定規律，目前的泥鰍不同倍體的發現均為通過實地采樣分析所得，暫無相關理論驗證。通過采樣調查，尚未在浙江省東部發現多倍體泥鰍。

3.2 泥鰍核型與地理種群 有研究表明，泥鰍存在明顯的地理種群現象[7-9]，而有學者則認為泥鰍屬區域性分布不明顯[10]。通過本次實驗表明，浙江省東部各地泥鰍核型一致，從染色體核型分析上尚不能進行有效的區分，需要進一步的進行染色體分析實驗。

參考文獻

[1]GB/T 18654-2008養殖魚類種質檢驗[S].2008.

[2]Lejeune，J.A PROPOSED STANDARD SYSTEM OF NOMENCLATURE OF HUMAN MITOTIC CHROMOSOMES[J].The Lancet，1960，275（7133）：1063-1065.

[3]印杰，趙振山，陳小奇，等.二倍體和四倍體泥鰍染色體組型比較[J].水生生物學報，2005，29（4）：469-472.

[4]王元軍.南四湖泥鰍資源現狀及開發[J].水利漁業，2005（04）：61-66.

[5]曾柳根，張偉，甘云飛，等.鄱陽湖泥鰍遺傳多樣性研究[J].水生生物學報，2010，34（5）：966-972.

[6]周玲玲，張桂蓉，魏開建，等.同域分布二倍體和四倍體泥鰍群體的遺傳結構[J].華中農業大學學報，2011（05）：624-630.

[7]馬綱.中國淡水魚類染色體形態及其數目變異的研究進展[J].甘肅科學學報，1996，8（3）：77-80.

[8]王軍萍，戴秀君，韓希福.河北省三種鰍科魚類的染色體組型[J].河北大學學報（自然科學版），1993，13（3）：51-54.

[9]常重杰，余其興.泥鰍Ag-NORs帶和C帶研究[J].河南師范大學學報（自然科學版），2000，28（2）：71-73.

[10]陳景星.中國花鰍亞科魚類系統分類的研究[A]//魚類學論文集（第一集）[C].北京：科學出版社，1981：21-32. （責編：張宏民）